A study of 40LoVe's role in xenopus development and the development of a novel intein based method for the in vivo conjugation of quantum dots to target proteins

Abstract

Η πρωτεΐνη Samba ανήκει στην οικογένεια των ετερογενών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεϊνών (hnRNPs). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι καταστέλλει την εξάπλωση των κυττάρων του ζωικού πόλου σε υπόστρωμα φιμπρονεκτίνης και επηρεάζει την μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας. Η πρωτεΐνη αυτή εκφράζεται σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια με αύξησή της κατά τη νευριδίωση, ενώ όσο προχωρά η ανάπτυξη περιορίζεται στους νευρικούς ιστούς. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την παρουσία της πρωτεΐνης αυτής σε κυτταρικό και εμβρυικό επίπεδο και γενικότερα τον ρόλο της κατά την ανάπτυξη. Η πρωτεΐνη αυτή εντοπίζεται σε ολόκληρο το κύτταρο, στον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα και την κυτταρική μεμβράνη. Φαίνεται να προσδένεται άμεσα ή έμμεσα στους μικροσωληνίσκους κατά την μίτωση και μεταφέρεται κατά μήκος των νευραξόνων, σε ώριμα έμβρυα. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιώντας μεθόδους FRAP και FLIP δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Samba μεταφέρεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα και αντίστροφα, γεγονός που επιβεβαιώνει το ρόλο της ως hnRNP. Η καταστολή της μεταγραφής με τη χρήση Morpholino, προκαλεί προβλήματα στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, γεγονός που ενισχύεται και από πειράματα υπερέκφρασης. Το ίδιο Morpholino, καταστέλλει την μετάφραση του εναλλακτικού μεταγράφου 40LoVe, καθώς και του παράλογου γονιδίου hnRNP AB, που είναι 93% πανομοιότυπο με την 40LoVe. Παρά τη μεγάλη ομολογία μεταξύ των 40LoVe/Samba και hnRNP AB, εντοπίζονται διαφορετικά στο κύτταρο, πιθανόν λόγω διαφορετικής λειτουργίας. Συγκρίνοντας τις πρωτεΐνες, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ο φαινότυπος που παρουσιάζεται στο νευρικό σύστημα, οφείλεται στην καταστολή της έκφρασης των 40LoVe/Samba. Επιπρόσθετα, είδαμε ότι η hnRNP AB έχει διαφορετική λειτουργία. Το σύνολο των πειραμάτων που διενεργήθηκαν απαιτούσαν προηγμένες τεχνικές απεικόνισης, με σκοπό την ζωντανή απεικόνιση χιμαιρικών πρωτεϊνών με φθορίζουσες πρωτεΐνες. Καταφύγαμε έτσι σε εναλλακτικούς τρόπους απεικόνισης για να μειώσουμε τα προβλήματα που παρουσιάζουν οι φθορίζουσες πρωτεΐνες, όσον αφορά τη φωτοσταθερότητα και τη φωτεινότητα. Οι νανοκρύσταλλοι (Quantum Dots-QDs) είναι ημιαγωγοί, με ιδανικές οπτικές ιδιότητες για την χρήση τους σε εφαρμογές βιοαπεικόνισης. Μέχρι στιγμής δεν υπήρχαν μεθοδολογίες που να επιτρέπουν την πρόσδεση των QDs σε πρωτεΐνες in vivo. Έτσι, το δεύτερο μέρος της διατριβής επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη πειραματικής μεθοδολογίας, για την ομοιοπολική πρόσδεση πρωτεϊνών με QDs in vivo και για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι inteins. Το καρβοξυτελικό άκρο της intein (IC) προσδέθηκε ομοιοπολικά in vitro στα QDs, ενώ το αμινοτελικό άκρο της intein (IΝ) προσδέθηκε μοριακά στην υπό εξέταση πρωτεΐνη. Το RNA που δημιουργήθηκε in vitro και τα IC-QD's εισάχθηκαν με μικροένεση στο έμβρυο. Αφού το RNA μεταφράζεται μέσα στον οργανισμό, το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης συνδέθηκε με το καρβοξυτελικό της άκρο και προκαλείται in vivo πρωτεϊνικό μάτισμα. Η πρωτεΐνη συνδεδεμένη πλέον με το QD, μπορεί να παρατηρηθεί σε πραγματικό χρόνο σε ζωντανό οργανισμό. Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόσδεση οποιασδήποτε νανοσυσκευής, σε οποιαδήποτε πρωτεΐνη, για την παρατήρηση σε όλα τα κυτταρικά διαμερίσματα ή σύμπλοκα σήμανσης σε κύτταρα του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Με τη χρήση QDs που εκπέμπουν στο υπέρυθρο, καταφέραμε να απεικονίσουμε δομές, που με τη χρήση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (EGFP), ήταν μη ανιχνεύσιμες λόγω βάθους, αναδεικνύοντας έτσι και τα πλεονεκτήματα της χρήσης QDs σε τέτοιου τύπου πειράματα.

Samba is a Xenopus hnRNP that was recently identified and has been shown to inhibit animal cap spreading and affect neural crest migration. It is expressed in all developmental stages and the expression appears elevated during neurula stages. At early neurula stages Samba is concentrated at the neural plate and later in the neural and neural crest tissues. At tailbud stages it is restricted in neural and neural crest derivatives including the brain, the spinal cord, the eyes and the brachial arches. Here we examined the protein localization at the cellular and embryonic level and also explored the role of the protein during development. We show that the protein is localized in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane. It becomes associated with microtubules during mitosis and it is transported in axons. We also show using FRAP and FLIP that Samba shuttles between the cytosol and the nucleus consistent with a role as an hnRNP. Loss of function experiments using antisense Morpholinos leads to defective neural development in agreement with the elevated expression of Samba in neural tissues. However, we also show that the Morpholino downregulates the splice variant 40LoVe and a paralog, hnRNP AB, which shares 93% identity with 40Love. Despite the high homology between 40LoVe/Samba and hnRNP AB, the proteins localize in distinct manners suggesting distinct functions in the embryo. We map the differences between the two proteins to the c-terminus and show that the neural phenotype is a consequence of 40LoVe/Samba downregulation arriving at the surprising conclusion that 40LoVe/Samba and hnRNP AB despite their extremely high homology are in fact functionally distinct. The aforementioned project required the application of advanced imaging modalities including the use of fluorescent protein fusions for live imaging, FRAP and FLIP and highlighted the limitations of protein fluorophores with respect to photostability and brightness. Quantum Dots (QDs) are nanometer semiconductor nanocrystals with ideal optical properties for use in biological imaging. However no methodologies exist that will allow the covalent and site specific conjugation of QDs to target proteins in vivo. The second part of this thesis focused on developing a methodology that would resolve these issues. We describe an intein based method to site-specifically conjugate QDs to target proteins in vivo. This approach allows the covalent conjugation of any nanostructure and/or nanodevice to any protein and thus the targeting of such material to any intracellular compartment or signaling complex within the cells of the developing embryo. The C-terminus half (IC) of the intein was conjugated to QDs in vitro. IC-QD's and RNA encoding PH-IN were microinjected into Xenopus embryos. In vivo intein-splicing resulted in fully functional QD-PH conjugates that could be monitored in real time within live embryos. Use of Near Infra Red (NIR)-emitting QDs allowed monitoring of QD-conjugates within the embryo at depths where EGFP is undetectable demonstrating the advantages of QD's for this type of experiment.