Identification and characterization of fetal specific methylated regions for non-invasive prenatal diagnosis

Abstract

Η προγεννητική διάγνωση έχει ως σκοπό τη διάγνωση των πιο κοινών εμβρυικών ανευπλοειδιών και ανωμαλιών. Σήμερα, ο μη επεμβατικός έλεγχος προσφέρεται σε όλες τις κυήσεις παρέχοντας ένα ρίσκο κινδύνου εμφάνισης των πιο συχνών ανωμαλιών του εμβρύου. Στις κυήσεις υψηλού ρίσκου η διάγνωση πραγματοποιείται με τη συλλογή εμβρυικού ιστού με επεμβατικές μεθόδους. Παρόλο που η διαδικασία αυτή προσφέρει μια υψηλής ακρίβειας διάγνωση, συνδέεται με ένα σημαντικό ποσοστό αποβολής. Επομένως, η ανάγκη για μείωση του ρίσκου αποβολής οδήγησε στην ανακάλυψη της παρουσίας ελεύθερου εμβρυικού DNA στο μητρικό περιφερικό αίμα. Αυτό αποτέλεσε ένα σημαντικό επίτευγμα στη ανάπτυξη μεθόδων μη επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης, οι οποίες είναι ασφαλέστερες και διαθέσιμες σε όλες τις εγκυμοσύνες. Αξιοποιώντας τις διαφορές μεθυλίωσης μεταξύ εμβρυϊκού DNA από πλακούντα και DNA μητρικού περιφερικού αίματος, αρκετές μελέτες έχουν εντοπίσει ένα αριθμό από εμβρυοειδικά διαφορικές μεθυλιωμένες περιοχές. Παρόλα αυτά η εφαρμογή τους αποτέλεσε πρόκληση λόγω των μικρών ποσοτήτων ελεύθερού εμβρυϊκού DNA εν τη παρουσία αυξημένων ποσοτήτων μητρικού DNA. Η ερευνητική μας ομάδα με τη χρήση της μεθοδολογίας Ανοσοκατακρήμνισης Μεθυλιωμένου DNA (MeDIP) σε συνδυασμό με μικροσυστοιχίες DNA κατάφερε να ταυτοποιήσει χιλιάδες διαφορικά μεθυλιωμένες περιοχές στα χρωμοσώματα 13, 21, 18, Χ και Υ. Αργότερα, χρησιμοποιώντας μια υποομάδα περιοχών κατάφεραν να διαγνώσουν κυήσεις με σύνδρομο Down με υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια. Ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός εμβρύοειδικών δεικτών για τα χρωμοσώματα 13, 18, 21, και Χ για χρήση τους στην ανάπτυξη ενός μη επεμβατικού προγεννητικού τεστ. Στο πρώτο στάδιο, χρησιμοποιήσαμε τα προαναφερθέντα δεδομένα μικροσυστοιχιών και επιλέξαμε ένα αριθμό περιοχών τις οποίες και χαρακτηρίσαμε. Επιβεβαιώσαμε τη διαφορά μεθυλίωσης μεταξύ εμβρυικού και μητρικού DNA σε τρείς, οκτώ και 12 περιοχές στα χρωμοσώματα 13, 18 και 21 αντίστοιχα. Ένα υποσύνολο αποτελούμενο από 15 περιοχές χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω χαρακτηρισμό σε 50 δείγματα χοριακών λαχνών και 50 δείγματα περιφερικού αίματος από μη έγκυες γυναίκες προκειμένου να διερευνηθεί η διακύμανση της μεθυλίωσης μεταξύ διαφορετικών ατόμων. Το συμπέρασμα ήταν ότι, παρά τη μεταβλητότητα της μεθυλίωσης μεταξύ των δειγμάτων η προσέγγιση μας παρείχε μια σαφή διάκριση μεταξύ του εμβρυικού και μητρικού ιστού. Το δεύτερο στάδιο αφορούσε τον σχεδιασμό και την εφαρμογή υπερ-υψηλής ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA. Η εφαρμογή αυστηρών κριτηρίων επιλογής επιβεβαίωσαν τη παρουσία διαφορικής μεθυλίωσης μεταξύ εμβρυικού και μητρικού ιστού σε 31, 22, 46 και δύο περιοχών στα χρωμοσώματα 13, 18, 21 και Χ αντίστοιχα. Η πλειονότητα των περιοχών αυτών βρέθηκε να βρίσκεται σε γονίδια πολλά από τα οποία συνδέονται με ασθένειες. Το τελευταίο στάδιο αφορούσε την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιώντας την μεθοδολογία αλληλούχισης επόμενης γενιάς σε συνδυασμό με τη μεθοδολογία MeDIP. Οι δύο προσεγγίσεις βρέθηκαν να είναι όμοιες αφού παρείχαν ακριβή αποτελέσματα σε σχέση με την ταυτοποίηση διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών. Συμπερασματικά, η εργασία μας παρέχει μια επέκταση στο πάνελ εμβρυοειδικών δεικτών που διατίθενται για NIPD του συνδρόμου Down και ειναι δυνατόν να αποτελέσει το σημείο εκκίνησης για την ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης άλλων συχνών ανευπλοειδιών. Επιπλέον, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι παρά το γεγονός ότι η διακύμανση της μεθυλίωσης είναι εμφανής, η διαφορά μεθυλίωσης στους δυο ιστούς είναι αρκετά μεγάλη ώστε να επιτρέπει την ιστο-ειδική ταυτοποίηση μεθυλίωσης.

Prenatal diagnosis aims to detect the most common aneuploidies and fetal abnormalities. It is routinely offered today as a non-invasive prenatal screening provided to all pregnancies or as an invasive procedure offered only to high risk pregnancies. While the former provides only a risk factor, the latter provides a more definitive diagnosis albeit associated with a significant rate of spontaneous miscarriages. Thus, the need of minimizing potential pregnancy risks has led to the discovery of cell free fetal DNA (cffDNA) in the maternal circulation, an important achievement towards the development of non-invasive prenatal diagnosis (NIPD) methodologies that are safer, more effective and available for all pregnancies. Taking advantage of the methylation differences between placenta derived cffDNA and the maternal blood, several studies have successfully identified a number of fetal specific differentially methylated regions (DMRs). Even though the implementation of DMRs in the detection of aneuploidies has proven to be a challenge due to the limited amount of cffDNA in the high maternal background, our group has previously combined methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) with high resolution array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and successfully identified thousands of candidate DMRs on chromosomes 13, 21 18, X and Y. Using a subset of these DMRs they were able to correctly classify Down syndrome pregnancies with high sensitivity and specificity. The main objective of this study was the identification and characterization of fetal specific biomarkers for chromosomes 13, 18, 21, and X for their potential utilization towards the development of an NIPD test. In the first stage we screened previously obtained aCGH data for the characterization of new fetal specific DMRs. We confirmed three, eight and 12 DMRs on chromosomes 13, 18 and 21 respectively. A subset was further validated in a set of 50 chorionic villus samplings (CVS) and 50 non-pregnant peripheral blood samples (WBF) in order to investigate the inter-individual methylation variability. It was concluded that despite the variability in the methylation between samples our approach provided a clear distinction between the fetal and maternal tissue. The second stage involved the design and implementation of ultra-high resolution aCGH. Implementing stringent selection criteria we confirmed the differential methylation pattern between CVS and WBF in 31, 22, 46 and two DMRs on chromosomes 13, 18, 21 and X respectively. The majority of DMRs were found to be located on genes many of which are associated with diseases. The last stage involved the confirmation of the MeDIP-Chip results using the MeDIP-seq approach. The two approaches were found to be highly consistent as they provided accurate and robust results in regards to the discovery of differentially methylated regions. In conclusion, our work provides an expansion in the biomarker panel available for NIPD for Down syndrome and can eventually provide the starting point towards the development for assays towards the detection of all common chromosomal aneuploidies. Furthermore, our data indicate that inter-experimental and inter-individual variation in methylation is apparent, yet the difference in methylation status across tissues is large enough to allow for robust tissue specific methylation identification.