Transgenic Replacement of Cx32 in Gap Junction-Deficient Oligodendrocytes Rescues the Phenotype of a Hypomyelinating Leukodystrophy Model

Abstract

Οι χασμοσυνδέσμοι στα ολιγοδενδροκύτταρα σχηματίζονται κυρίως από την κοννεξίνη 47 (Cx47) και κοννεξίνη 32 (Cx32). Υπολειπόμενες μεταλλάξεις στο γονίδιο GJC2, της Cx47 προκαλούν την ασθένεια Pelizaeus-Merzbacher, η οποία υπάγεται στην κατηγορία των υπομυελινωτικών λευκοδυστροφιών, ενώ μεταλλάξεις στο γονίδιο GJB1, της Cx32 προκαλούν περιφερική νευροπάθεια, χρόνια ή οξεία παροδική εγκεφαλοπάθεια. Τα ποντίκια στα οποία λείπουν και τα δύο γονίδια της Cx32 και Cx47 (Cx32/Cx47dKO) αναπτύσσουν σοβαρή απομυελίνωση του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) που αρχίζει σε ηλικία ενός μηνός και οδηγεί στο θάνατο μέσα σε λίγες εβδομάδες. Αυτό το μοντέλο λευκοδυστροφίας προσφέρεται για μελέτη των μηχανισμών αυτή της νόσου. Προκειμένου να διευκρινιστεί αν η απώλεια των χασμοσυνδέσμων στα ολιγοδενδροκυττάρα έχει αυτόνομες κυτταρικές επιδράσεις, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν την άγριου-τύπου ανθρώπινη Cx32 υπό τον έλεγχο του υποκινητή της πρωτεολιπιδικής πρωτεΐνης ποντικού για την απόκτηση εξωγενούς έκφρασης hCx32 σε ολιγοδενδροκύτταρα. Με την αναπαραγωγή των ιδρυτών με Cx32KO ποντίκια, πήραμε την έκφραση της hCx32 σε Cx32KO ποντίκια, που επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία και ανοσοαποτύπωση. Παρατηρήσαμε έντονη έκφραση της στα ολιγοδενδροκύτταρα του ΚΝΣ στα TG+Cx32KO ποντίκια όπως επίσης εντοπισμό και ο σχηματισμό χασμοσυνδέσμων σε αυτά κατά μήκος της μυελίνης. Με περαιτέρω διασταύρωση αυτών των ποντικιών με Cx47KO ποντίκια δημιουργηθήκαν τα TG+Cx32/Cx47dKO τα οποία έδειξαν ότι η διαγονιδιακή έκφραση της hCx32 έσωσε τη σοβαρή απομυελίνωση του ΚΝΣ σε ποντίκια Cx32/Cx47dKO, με αποτέλεσμα την σημαντική βελτίωση των ανωμαλιών συμπεριφοράς από τον 1ο μήνα της ηλικίας τους, και την πρόληψη της πρόωρης θνησιμότητας. Επιπλέον, οι TG+Cx32/Cx47dKO ποντικοί έδειξαν σημαντική βελτίωση της απομυελίνωσης ενώ οι φλεγμονές και οι αστρογλιοτικές αλλαγές αντιστράφηκαν πλήρως σε σύγκριση με τους Cx32/Cx47dKO στον 1 μήνα ηλικίας. Η μελέτη μας επιβεβαιώνει ότι η απώλεια των χασμοσυνδέσμων στα ολιγοδενδροκυττάρα έχει αυτόνομες επιδράσεις και με την αντικατάσταση τουλάχιστον μιας κοννεξίνης επιτυγχάνεται η διόρθωση του φαινοτύπου της λευκοδυστροφίας και επανασύνδεση των χασμοδυνδέσμων.

Oligodendrocytes are coupled by gap junctions (GJs) formed mainly by connexin47 (Cx47) and connexin32 (Cx32). Recessive GJC2/Cx47 mutations cause Pelizaeus–Merzbacher-like disease, a hypomyelinating leukodystrophy, while GJB1/Cx32 mutations cause peripheral neuropathy and chronic or acute-transient encephalopathy syndromes. Cx32/Cx47 double knockout (Cx32/Cx47dKO) mice develop severe CNS demyelination beginning at 1 month of age leading to death within weeks, offering a relevant model to study disease mechanisms. In order to clarify whether the loss of oligodendrocyte connexins has cell autonomous effects, we generated transgenic mice expressing the wild-type human Cx32 under the control of the mouse proteolipid protein (Plp) promoter, obtaining exogenous hCx32 expression in oligodendrocytes. By crossing these mice with Cx32KO mice, we obtained expression of hCx32 on Cx32KO background. Immunohistochemical and immunoblot analysis confirmed strong CNS expression of hCx32 specifically in oligodendrocytes and correct localization forming GJs at cell bodies and along the myelin sheath. TG+Cx32/Cx47dKO mice were generated by further crossing with Cx47KO mice. Transgenic expression of hCx32 rescued the severe early phenotype of CNS demyelination in Cx32/Cx47dKO mice, resulting in marked improvement of behavioral abnormalities at 1 month of age, and prevented the early mortality. Furthermore, TG+Cx32/Cx47dKO mice showed significant improvement of myelination compared with Cx32/Cx47dKO CNS at 1 month of age, while the inflammatory and astrogliotic changes were fully reversed. Our study confirms that loss of oligodendrocyte GJs has cell autonomous effects and that re-establishment of GJ connectivity by replacement of at least one GJ protein provides correction of the leukodystrophy phenotype.