The role of histone N-terminal acetyltransferase Naa40 in gene expression and colorectal cancer cell death

Abstract

Η αμινο-τελική ακετυλίωση (Nτ-ακετυλίωση) των πρωτεϊνών αποτελεί μία από τις συνηθέστερες τροποποιήσεις που παρουσιάζονται στο 80-90% των κυτταροπλασματικών, ευκαρυωτικών πρωτεϊνών. Αυτή η τροποποίηση έχει αναδειχθεί ως σημαντικός ρυθμιστής των πρωτεϊνών στόχων, επιφέροντας αξιοσημείωτες συνέπειες στη δράση τους. Αλλαγές στη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης-στόχου στο κύτταρο, η διευκόλυνση αλληλεπιδράσεων καθώς και η συμμετοχή των πρωτεϊνών-στόχων σε μονοπάτια μεταβολισμού είναι μόνο λίγες από τις πολλαπλές επιπτώσεις που επιφέρει η προσθήκη της ακετυλομάδας στο αμινο-τελικό άκρο των πρωτεϊνών-στόχων. Η Nτ-ακετυλίωση καταλύεται από εξελικτικά συντηρημένες πρωτεΐνες, γνωστές ως αμινο-τελικές ακετυλτρανσφεράσες (ΝΑΤs). Η απορρύθμιση αυτών των ενζύμων έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη καρκινικών όγκων και ως εκ τούτου, έχουν αναδειχθεί ως υποσχόμενοι στόχοι σε διαγνωστικές και θεραπευτικές αντικαρκινικές μεθόδους. Η Ντ-ακετυλτρανσφεράση 4 (Naa40) αποτελεί μία εξαιρετικά εκλεκτική αμινο-τελική ακετυλτρανσφεράση, καθώς ακετυλιώνει μόνο δύο πρωτεΐνες-στόχους, την ιστόνη Η4 και την ιστόνη Η2Α. Στον ζυμομύκητα, ο οποίος αποτελεί χρήσιμο απλουστευμένο μοντέλο οργανισμού, η Naa40 παρουσιάζεται ως σημαντικός αισθητήρας της κυτταρικής ανάπτυξης. Στην παρούσα μελέτη εξετάζουμε τον βιολογικό και μοριακό ρόλο της Naa40 στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Αποδεικύουμε ότι η απουσία έκφρασης και δράσης της Naa40 στις HCT116 και ΗΤ-29 ανθρώπινες κυτταροσειρές ορθοκολικού καρκίνου, μειώνει την επιβίωση των κυττάρων ενεργοποιώντας το μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι, καθώς η ιστόνη Η4 παύει να φέρει την αμινοτελική ακετυλίωση. Αντιθέτως, η απουσία της Naa40 σε εμβρυϊκούς, μη καρκινικούς ινοβλάστες ποντικού (STO κύτταρα) δεν επιφέρει καμία αλλαγή στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Συγκεκριμένα, η μείωση της Naa40 σε καρκινικά κύτταρα με επεμβατικές RNA αλληλουχίες (siRNAs), οδηγεί στην ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής κασπάσης-9, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί άλλες εκτελεστικές κασπάσες, ούτως ώστε να επέλθει κυτταρικός θάνατος. Η απαραίτητη συμμετοχή της κασπάσης-9 στην επαγωγή της απόπτωσης επιβεβαιώνεται με τη χρήση μη αναστρέψιμου αναστολέα κατά της κασπάσης-9, όπου, παρόλο που η Νaa40 απουσιάζει, η απόπτωση παρεμποδίζεται. Σημαντική είναι η ανακάλυψη που αποδεικνύει ότι η ενεργοποίηση του αποπτωτικού μηχανισμού προκαλείται χωρίς τη συμμετοχή της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53, η οποία είναι συχνά μεταλλαγμένη και ανενεργή στους πλείστους καρκίνους. Ο ρόλος της Naa40 στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης έχει επίσης διερευνηθεί. Αρχικά, δείξαμε ότι η δράση της Ναα40 είναι απαραίτητη για την έκφραση του ριβοσωμικού RNA, καθώς η απουσία του ενζύμου οδήγησε στη μείωση των επιπέδων του ριβοσωμικού RNA. Αυτή η παρατήρηση συνάδει με την πρόσφατη ανακάλυψη ότι η Naa40 ενεργοποιεί το ριβοσωμικό DNA στον ζυμομύκητα, καταδεικνύοντας την εξελικτικά συντηρημένη δράση της. Επιπλέον, δείξαμε ότι κατά την απώλεια της Naa40, η έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων είναι σημαντικά εξασθενημένη, ενώ αντιθέτως, η έκφραση των προ-αποπτωτικών γονιδίων εντείνεται. Αυτά τα ευρήματα ενισχύουν τον αντι-αποπτωτικό ρόλο της Νaa40 και υποδηλώνουν ότι, η αμινοτελική ακετυλομάδα που διακοσμεί την ιστόνη Η4, λόγω της δράσης της Naa40, είναι απαραίτητη για τη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στην επιβίωση των κυττάρων. Η μείωση της Naa40 στα κύτταρα επέφερε αλλαγές και σε άλλες επιγενετικές τροποποιήσεις. Σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στα επίπεδα της συμμετρικής μεθυλίωσης της αργινίνης 3 στην ιστόνη H4 (H4R3me2s) καθώς και αύξηση της τριπλής μεθυλίωσης στη λυσίνη 4 της ιστόνης Η3 (H3K4me3). Οι προαναφερθείσες τροποποιήσεις αντιπροσωπεύουν την καταστολή και την ενεργοποίηση σημάτων της μεταγραφής, αντιστοίχως. Αυτή η παρατήρηση εξηγεί την ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών γονιδίων στην απουσία της Naa40 ογκοπρωτεΐνης. Τέλος, δείξαμε ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση της PRMT5 μεθυλτρανσφεράσης, η οποία είναι υπεύθυνη για την κατάλυση της H4R3me2s και η οποία συχνά υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκινικούς τύπους, εξαρτάται άμεσα από τη δράση της Naa40. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν τον αντι-αποπτωτικό ρόλο της Naa40 και την προτείνουν ως ένα υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο στους ορθοκολικούς καρκίνους.

Protein N-alpha terminal acetylation (Nt-acetylation) is an abundant modification occurring on 80-90% of cytoplasmic, eukaryotic proteins. This modification has emerged as an important protein regulator with various and significant implications, including changes in protein stability, protein localisation and metabolism. Nt-acetylation is catalysed by evolutionarily conserved N-terminal acetyltransferases (NATs) whose deregulation has been linked to cancer development and thus, are emerging as useful diagnostic and therapeutic targets. Naa40 is a highly selective NAT that acetylates the amino-termini of histones H4 and H2A and acts as a sensor of cell growth in yeast. In the present study, we examine the biological and molecular role of Naa40 in cancer cell survival. We first demonstrate that depletion of Naa40 in HCT116 and HT-29 colorectal cancer cells decreases cell survival by enhancing apoptosis, whereas Naa40 reduction in non-cancerous mouse embryonic fibroblasts (STO cells) has no effect in cell viability. Specifically, Naa40 knock-down in colon cancer cells activates the mitochondrial caspase-9-mediated apoptotic cascade. Consistent with this, we show that caspase-9 activation is required for the induced apoptosis because treatment of cells with an irreversible caspase-9 inhibitor impedes apoptosis when Naa40 is depleted. Additionally, the effect of Naa40-depletion on cell-death is mediated through a p53-independent mechanism since p53-null HCT116 cells still undergo apoptosis upon reduction of the acetyltransferase. Furthermore, we look into the role of Naa40 in the regulation of gene expression. Initially, we show that depletion of Naa40 results in reduced levels of ribosomal RNA transcripts, which is consistent with the recently described function of yeast Naa40. Also, we show that upon Naa40 loss, the expression of anti-apoptotic genes is impaired whereas the expression of pro-apoptotic genes is up-regulated. These findings, together with the aforementioned identified anti-apoptotic role of Naa40 suggest that N-acH4 mediated by Naa40 is necessary for transcriptional activation of genes implicated in cell survival. Moreover, Naa40 knockdown results in a significant reduction of H4R3me2s and a great elevation of H3K4me3, which represent repressive and activation marks of transcription, respectively. Interestingly, we show that transcriptional activation of PRMT5 methyltransferase, which is responsible for catalysing H4R3me2s and which is frequently over-expressed in many cancer cell types, is dependent upon Naa40 activity. Altogether, these findings reveal the anti-apoptotic role of Naa40 and exhibit its potential as a therapeutic target in colorectal cancers.