Elucidation of the effects of solid stress on fibroblasts and cancer cells behavior in solid tumors

Abstract

Οι συμπαγείς καρκινικοί όγκοι αποτελούνται από καρκινικά και μη καρκινικά κύτταρα, όπως είναι οι ινοβλάστες και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, από την εξωκυττάρια μήτρα η οποία είναι ένα πλέγμα από πρωτεΐνες και μακρομοριακές αλυσίδες (κολλαγόνο, υαλουρονικό οξύ, ινωνεκτίνη) καθώς και από το αγγειακό του σύστημα. Η υπερβολική παραγωγή των πρωτεϊνών αυτών στην εξωκυττάρια μήτρα, μια κατάσταση γνωστή ως δεσμοπλασία, μαζί με τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων στον περιορισμένο χώρο του οργάνου στο οποίο αναπτύσσονται, οδηγούν στην ανάπτυξη μηχανικών δυνάμεων συμπίεσης εντός του όγκου, για το οποίο χρησιμοποιείται ο αγγλικός όρος solid stress. Το solid stress είναι βασικό χαρακτηριστικό της βιομηχανικής αρκετών συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος και του εγκεφάλου, και έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί για το πώς εμπλέκεται στην εξέλιξη του όγκου και ιδιαίτερα στην μετάσταση δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί. Επιπλέον, ενώ η επίδραση των μηχανικών τάσεων στα καρκινικά κύτταρα ήδη διερευνάται, δεν υπάρχει ακόμα κάποια σχετική μελέτη που να εξετάζει την επίδρασή τους στους ινοβλάστες, οι οποίοι αποτελούν σημαντικό συστατικό στο μικροπεριβάλλον ενός όγκου. Αυτό γιατί όταν οι ινοβλάστες βρίσκονται σε καρκινικό περιβάλλον αποκτούν ένα συνεχώς ενεργοποιημένο φαινότυπο παράγοντας υπερβολικές ποσότητες πρωτεϊνών της εξωκυττάριας μήτρας οδηγώντας σε δεσμοπλασία, ενώ ταυτόχρονα αλληλεπιδρούν με τα καρκινικά κύτταρα προωθώντας την εξέλιξη του όγκου. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίπτωση των μηχανικών τάσεων στα καρκινικά κύτταρα και στους ινοβλάστες που συναντώνται σε ένα καρκινικό μικροπεριβάλλον, χρησιμοποιήσαμε μια αυτοσχέδια διάταξη για την εφαρμογή προκαθορισμένης μηχανικής τάσης σε καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες παγκρέατος, καθώς επίσης και σε καρκινικά κύτταρα εγκεφάλου. Το μέγεθος των τάσεων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν παρόμοιο με αυτό που δέχονται τα κύτταρα σε πραγματικούς όγκους. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μηχανική τάση διεγείρει την ενεργοποίηση των ινοβλαστών και αυξάνει έντονα την έκφραση του παράγοντα διαφοροποίησης ανάπτυξης-15 (Growth Differentiation Factor-15, GDF15). Επιπλέον, η συν-καλλιέργεια των συμπιεσμένων αυτών ινοβλαστών με καρκινικά κύτταρα παγκρέατος φάνηκε να προάγει σημαντικά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, η οποία αναστέλλεται μετά από τεχνική μείωση των επιπέδων του GDF15 στους ινοβλάστες. Στη συνέχεια, με εφαρμογή μηχανικής συμπίεσης απευθείας πάνω σε καρκινικά κύτταρα παγκρέατος, παρατηρήθηκε αύξηση της μεταναστευτικής τους ικανότητας συνοδευόμενη από έντονη αύξηση του παράγοντα GDF15. Πραγματοποιώντας μια ανάλυση των επιπέδων φωσφο-πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα, ανακαλύψαμε ότι ο μηχανισμός με τον οποίο μεταφέρεται το σήμα της μηχανικής συμπίεσης βασίζεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι Akt / CREB1 το οποίο μπορεί να ρυθμίζει μεταγραφικά την έκφραση του GDF15 στα καρκινικά κύτταρα, έτσι ώστε να προωθήσει στην συνέχεια την μετανάστευσή τους. Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η μηχανική τάση μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη καρκινικών σφαιροειδών του εγκεφάλου, και ταυτόχρονα να ρυθμίσει διαφορικά την μεταναστευτική ικανότητα και γονιδιακή έκφρασή τους. Συγκεκριμένα, εντοπίσαμε μία έντονη αύξηση στην έκφραση του παράγοντα GDF15 σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του εγκεφάλου ανεξάρτητα από το μεταναστευτικό τους δυναμικό, ενώ παρατηρήθηκε μια αύξηση και μείωση της έκφρασης του παράγοντα RhoB GTPase στα λιγότερο μεταναστευτικά κύτταρα γλοιώματος και στα επιθετικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος, αντίστοιχα. Παρόλο που απαιτούνται περαιτέρω πειράματα για να προτείνουμε έναν ολοκληρωμένο μηχανισμό με τον οποίο η μηχανική τάση μπορεί να προωθήσει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του εγκεφάλου, τα μέχρι τώρα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν έναν καθοριστικό ρόλο της μηχανικής τάσης στην εξέλιξη του όγκου, καθιστώντας το GDF15 και άλλα μόρια όπως το RhoB ως δυνητικούς βιοδείκτες για την παρουσία μηχανικών τάσεων σε πραγματικούς όγκους και προτείνοντας αυτά τα γονίδια σαν νέους μοριακούς στόχους για μελλοντικές καινοτόμες θεραπείες ενάντια στην ρυθμιζόμενη από μηχανικές τάσεις μετάσταση.

Apart from cancer cells, solid tumors consist of non-cancerous cells, such as fibroblasts and immune cells, an extracellular matrix (ECM) that forms a network of fibrillar proteins and macromolecular chains, including collagen, hyaluronan and fibronectin, and a vascular system. The excessive production of ECM proteins, a condition known as desmoplasia, along with the uncontrolled proliferation of cancer cells in the confined space of the host tissue, leads to the development of compressive forces within the tumor, generating the so-called solid stress. Solid stress is a characteristic biomechanical abnormality of several solid tumors, including breast, colon, pancreatic and brain cancer, and it has been previously shown to affect cancer cell proliferation and migration. However, the underlying mechanisms of how it is implicated in tumor progression, and especially in cancer cell metastasis, is not yet fully understood. Moreover, while the effect of solid stress on cancer cells is currently being investigated, there is no pertinent study considering its effect on fibroblasts and whether these effects contribute to tumor progression. In fact, fibroblasts are continuously gaining ground as an important component of tumor microenvironment. They might acquire a constantly activated phenotype producing excessive amounts of extracellular matrix leading to desmoplasia, while they dynamically interact with cancer cells to promote tumor progression. The objective of this research was to investigate the implication of solid stress in cancer cells and fibroblasts. For this purpose, we employed a custom-made device to apply a predefined compressive stress on pancreatic cancer cells and fibroblasts, as well as on brain cancer cells, similar in magnitude to that experienced by cells in native tumors. Our results suggest that solid stress stimulates fibroblasts activation and strongly upregulates Growth Differentiation Factor-15 (GDF15) expression. Moreover, co-culture of compression-induced activated fibroblasts with pancreatic cancer cells significantly promotes cancer cell migration, which is inhibited by shRNA-mediated silencing of GDF15 in fibroblasts. By applying mechanical compression directly on pancreatic cancer cells, we found an increase in their metastatic potential accompanied by a strong upregulation of GDF15 expression. Subsequently, with the use of a phosphoprotein screening, we identified a solid stress-induced mechanism relied on the Akt/CREB1 pathway that can transcriptionally regulate GDF15 expression in order to promote cancer cell migration. Finally, we found that solid stress can impair the growth of brain cancer multicellular spheroids and it can differentially regulate their migration and gene expression profile. Specifically, we identified a strong increase in GDF15 expression of two distinct brain cancer cell lines regardless of their metastatic potential, while an upregulation and downregulation of RhoB GTPase was observed in the less metastatic glioma cells and highly aggressive glioblastoma cells, respectively. Even though future studies are needed to reveal a comprehensive mechanism of how solid stress induces the migration of brain cancer cells, our results suggest a novel regulatory role of solid stress in tumor progression, rendering GDF15 and other molecules such as RhoB, as potential biomarkers for the presence of solid stress in vivo and molecular targets for future anti-metastatic therapeutic innovations.