Μελέτη των αντιδράσεων υπεροξειδασών και αιμο-σφαιρινών με το νιτρώδες ιόν (NO2-) με τη χρήση φασματοσκοπίας συντονισμού Raman

Abstract

Τα νιτρώδη είναι ένας ισχυρός οξειδωτικός παράγοντας ο οποίος αλληλεπιδρά με τις αιμοπρωτεΐνες μέσω ποικίλων μονοπατιών. Αυτά τα μονοπάτια περιλαμβάνουν αντιδράσεις με τον αιμικό σίδηρο, τον σκελετό της αίμης και κατάλοιπα των πρωτεϊνών. Οι αλληλεπιδράσεις των νιτρωδών με τις αιμοπρωτεΐνες μπορούν να οδηγήσουν σε δομικές και λειτουργικές αλλαγές, στις πρωτεΐνες οι οποίες μπορεί να συμβάλουν στην τροποποίηση της ενεργότητάς τους. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι αντιδράσεις των νιτρωδών με τέσσερις αιμοπρωτεΐνες με τη χρήση της φασματοσκοπίας συντονισμού Raman. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν από την κατηγορία των υπεροξειδασών η υπεροξειδάση χρένου (HRP) και η λακτοπεροξειδάση (LPO) και από την κατηγορία των αίμο-σφαιρινών η μυοσφαιρίνη (Mb) και η αιμοσφαιρίνη (Hb). Μελετήθηκαν οι αντιδράσεις των HRP (αίμη-Fe3+) και HRP (αίμη Fe4+=O) με το νιτρώδες ιόν. Η αντίδραση HRP (αίμη-Fe3+) /ΝΟ2- σε ουδέτερο pH οδηγεί σε μερική νίτρωση της βινυλικής ομάδας της αίμης, όπως παρατηρείται από τη χαρακτηριστική δόνηση sym(NO2) της ομάδας - C=C-NO2 στους 1334 cm-1 στα φάσματα συντονισμού Raman, χωρίς να παρατηρείται δέσμευση στον αιμικό Fe. Αντίθετα, σε όξινο pH πέρα από τη νίτρωση της βινυλικής ομάδας, το ΝΟ2- δεσμεύεται στον αιμικό Fe σε νίτρο διαμόρφωση (δέσμευση μέσω του Ν), όπως προκύπτει από το χαρακτηρισμό της δομής του συμπλόκου αυτού με φασματοσκοπία συντονισμού Raman μέσω της ανίχνευσης των δονήσεων (Fe-NO2) στους 563 cm-1, (FeNO2) στους 822 cm-1 και sym (NO2) στους 1272 cm-1. Η ευαισθησία των δονήσεων του συμπλόκου αίμης Fe-NO2 στην ανταλλαγή H/D υποδεικνύει την αλληλεπίδραση μέσω δεσμού υδρογόνου του δεσμευμένου στην αίμη ΝΟ2- με κατάλοιπο της μακρινής θέσης της αίμης, δείχνοντας ότι το πρωτεϊνικό περιβάλλον καθορίζει τον τρόπο δέσμευσης. Κατά την αντίδραση HRP(αίμη Fe4+=O)/ΝΟ2- παρατηρείται νίτρωση της βινυλικής ομάδας σε μεγαλύτερο βαθμό. Προκαταρκτικά πειράματα ελέγχου της ενεργότητας του ενζύμου, δείχνουν μείωση της ενεργότητας παρουσία νιτρωδών, γεγονός που αποδίδουμε εν μέρει στην τροποποίηση της αίμης λόγω νίτρωσης της βινυλικής ομάδας. Το δεύτερο μέλος της οικογένειας των υπεροξειδασών που μελετήθηκε είναι η LPO, και συγκεκριμένα εξετάστηκε η αντίδραση LPO (αίμη-Fe3+)/NO2-. Οι διαφορές που παρατηρούνται στο περιβάλλον της αίμης των δύο υπεροξειδασών είναι καθοριστικές για τον τρόπο που αντιδρούν με το ΝΟ2-. Συγκεκριμένα, κατά την αντίδραση LPO/NO2- δεν παρατηρήθηκε η νίτρωση βινυλικής ομάδας της αίμης. Οι εστερικοί δεσμοί που σχηματίζουν τα κατάλοιπα D108 και E258 με τις μεθυλικές ομάδες των πυρολικών δακτυλίων της αίμης στην LPO, προστατεύουν τις βινυλικές ομάδες από ηλεκτρονιόφιλες προσβολές. Το NO2- δεσμεύεται στον αιμικό Fe σε νίτρο διαμόρφωση όταν η αντίδραση πραγματοποιείται σε pH 5.5, σύμπλοκο το οποίοχαρακτηρίστηκε με την ανίχνευση των δονήσεων (FeNO2) στους 821 cm-1 και sym (NO2) στους 1329 cm-1 στα φάσματα συντονισμού Raman. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε επίσης η αντίδραση Mb (αίμη-Fe3+)/NO2-. Η παρατεταμένη επώαση της πρωτεΐνης με νιτρώδη οδήγησε στο σχηματισμό ενός συμπλόκου χαμηλού σπιν, με το ΝΟ2- ενταγμένο στον αιμικό σίδηρο σε νίτριτο διαμόρφωση (αίμη-Fe-ONO) και το σχηματισμό της 2-νιτροβινυλικής ομάδας της αίμης. Με απομάκρυνση των νιτρωδών από το διάλυμα, παρατηρείται εναλλαγή στην κατάσταση σπιν του συμπλόκου, χωρίς την αποδέσμευση του υποκαταστάτη από τον αιμικό Fe. Αυτό είναι το πρώτο παράδειγμα μιας σφαιρίνης, η οποία μπορεί αντιστρεπτά να μεταβάλει την κατάσταση σπιν του αιμικού σιδήρου χωρίς αλλαγή υποκαταστάτη. Στην περίπτωση της μελέτης των αντίστοιχων αντιδράσεων Ηb (αίμη-Fe3+)/NO2- τα αποτελέσματα διαφοροποιούνται. Η αντίδραση των νιτρωδών με την Hb σε ουδέτερο pH οδηγεί στο σχηματισμό μείγματος νίτριτο (αίμη Fe-ONO) συμπλόκων με υψηλoύ και χαμηλού σπιν διαμορφώσεις, που συνυπάρχουν σε ισορροπία σε θερμοκρασία δωματίου. Η παρατεταμένη επώαση της Hb στο διάλυμα των νιτρωδών οδηγεί στο σχηματισμό χαμηλού σπιν συμπλόκου αίμης-Fe-ONO/ νιτροβινυλικού. Σε αντίθεση με τη συμπεριφορά που παρατηρηθεί για τη Mb, με την απομάκρυνση της περίσσειας των νιτρωδών το σύμπλοκο της Hb παραμένει σε κατάσταση χαμηλού σπιν.

Nitrite is a powerful oxidizing agent that interacts with hemoproteins in variable reaction pathways. These pathways include reactions at the heme iron, the heme macrocycle, and protein residues. The interactions of nitrite with hemoproteins can lead to structural and functional changes that can modify protein activity. In the present dissertation, the reactions of nitrite with four hemoproteins were studied using resonance Raman spectroscopy. Specifically, horseradish peroxidase (HRP) and lactoperoxidase (LPO) were studied from the peroxidase family and myoglobin (Mb) and hemoglobin (Hb) from the heme-globin family. The reactions of HRP (heme-Fe3+) and HRP (heme Fe4+ = O) with the nitrite ion were studied. The HRP (heme-Fe3+) / NO2- reaction at neutral pH leads to partial nitration of the heme vinyl group, as observed by the characteristic νsym (NO2) vibration of the -C = C-NO2 group at 1334 cm-1 in the Raman spectra, without ligand binding to the heme Fe. In contrast, at acidic pH, in addition to the heme vinyl group nitration, NO2- binds to the heme Fe in the nitro configuration (binding through the N-atom), as evidenced by the resonance raman characterization of the adduct through the detection of the ν(Fe-NO2) at 563 cm-1, δ(FeNO2) at 822 cm-1 and νsym (NO2) at 1272 cm-1. The sensitivity of the vibrations of the heme Fe-NO2 a d d u c t to the H / D exchange indicates hydrogen bonding interaction of the heme-bound NO2- with residues in the distal side of the heme, demonstrating that the protein environment determines the binding mode. In the HRP (heme Fe4+= O) / NO2- reaction nitration of the vinyl group is observed to a greater extent. Preliminary activity experiments show a decrease in the enzymatic activity of HRP in the presence of nitrite, which we partially attribute to the modification of the heme macrocyle due to the nitration of the vinyl group. The second member of the peroxidase family studied herein is LPO, and in particular the LPO (heme-Fe3+) / NO2- reaction was investigated. The differences observed in the heme environment of the two peroxidases are crucial in their reactions with NO2-. In particular, during the LPO / NO2- reaction, nitration of the heme vinyl group was not observed. The ester bonds formed by residues D108 and E258 with the methyl groups of heme pyrole rings in LPO protect the vinyl groups from electrophilic attacks. Nitrite binds to heme Fe in the nitro binding mode when the reaction is performed at pH 5.5. The heme-nitro adduct was characterized by the detection of δ(FeNO2) vibration at 821 cm-1 and νsym (NO2) at 1329 cm-1 in the resonance Raman spectra. The Mb (heme-Fe3+) / NO2- reaction was also studied in the present dissertation. Prolonged incubation of the protein with nitrite resulted in the formation of a low spin complex, with NO2- binding to the heme iron in a nitrito configuration (heme-Fe-ONO) and formation of the heme 2-nitrovinyl group. By removing nitrite from the solution, a change in the spin state of the adduct is observed, without the release of the ligand from the heme Fe. This is the first example of a globin, which can inversely change the spin state of the heme iron without ligand exchange. In the study of the corresponding Hb (heme-Fe3+) / NO2 - reactions the results are different. The reaction of nitrite with Hb at neutral pH leads to the formation of a nitrito (heme Fe-ONO) adduct that exists in high and low spin configurations in equilibrium at room temperature. Prolonged incubation of Hb with nitrite leads to the formation of a low spin heme-Fe-ONO / nitrovinyl complex. In contrast to the behavior observed for Mb, when removing the excess nitrite from the solution, a spin transition does not occur, rather the heme-Fe-ONO/nitrovinyl adduct remains in the low-spin state.