Σύνδρομο Alport και Νεφροπάθεια της Λεπτής Βασικής Μεμβράνης: Χαρακτηρισμός δύο νέων ζωικών μοντέλων και μελέτες σε Κύπριους ασθενείς

Abstract

Το σύνδρομο Alport (ΣΑ) είναι είδος κληρονομικής νεφροπάθειας που οδηγεί αναπόφευκτα σε τελικό στάδιο χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (ΤΣΧΝΑ) και μέχρι σήμερα δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για αυτό. Οφείλεται σε μεταλλάξεις στα γονίδια COL4A3, COL4A4 και COL4A5 τα οποία κωδικοποιούν για τις α3, α4 και α5 αλυσίδες αντίστοιχα του κολλαγόνου τύπου IV, το οποίο αποτελεί ένα από τα κύρια συστατικά της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (ΣΒΜ). Το 85% των περιπτώσεων παρουσιάζουν φυλοσύνδετη κληρονόμηση, ενώ το 15% κληρονομείται κατά τον αυτοσωματικό υπολειπόμενο χαρακτήρα. Οι ετερόζυγοι φορείς του αυτοσωματικού υπολειπόμενου Alport πάσχουν από τη Νεφροπάθεια της Λεπτής Βασικής Μεμβράνης (ΝΛΒΜ). Τα νοσήματα αυτά χαρακτηρίζονται από σημαντική γενετική και φαινοτυπική ετερογένεια. Παρά το γεγονός ότι οι πλείστες μεταλλάξεις που ευθύνονται για το σύνδρομο Alport αφορούν στην αντικατάσταση ενός μονήρους αμινοξέος, εντούτοις απουσιάζει μέχρι στιγμής από τη βιβλιογραφία η λεπτομερής περιγραφή ενός knockin μοντέλου ποντικού για το ΣΑ. Στη μελέτη αυτή έγινε πλήρης φαινοτυπική ανάλυση δύο μοντέλων ποντικού για το ΣΑ. Πρόκειται για ένα knockin μοντέλο το οποίο φέρει την παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη Col4α3-p.G1332E και ένα σύνθετο ετερόζυγο μοντέλο το οποίο φέρει την Col4α3-p.G1332E και ένα Col4α3 knocked out αλληλόμορφο. Η μετάλλαξη αυτή είναι η ομόλογη της COL4A3-p.G1334E στον άνθρωπο και συναντάται ιδιαίτερα συχνά ανάμεσα στους Κύπριους ετεροζυγώτες φορείς μεταλλάξεων στα COL4A γονίδια, ως αποτέλεσμα του φαινομένου του ιδρυτή. Παράλληλα, πολλοί ασθενείς με ΣΑ είναι σύνθετοι ετεροζυγώτες φορείς μεταλλάξεων στα COL4A3, COL4A4 και COL4A5 γονίδια. Τα ευρήματα από τη μελέτη των δύο ζωικών μοντέλων είναι συμβατά με τα χαρακτηριστικά του ΣΑ (μειωμένη επιβίωση, διαταραχή των βιοχημικών δεικτών στο αίμα και τα ούρα ενδεικτική νεφρικής νόσου, ιστολογικά ευρήματα αυξημένης ίνωσης στα σπειράματα και στο διαμεσοσωληναριακό ιστό και χαρακτηριστικές παθογνωμονικές για το ΣΑ ανωμαλίες της ΣΒΜ κατά τη μελέτη με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήματα από τα πειράματα ανοσοφθορισμού σε κρυοτομές νεφρικού ιστού και από τις μελέτες ανοσοαποτύπωσης, τα οποία δεικνύουν ότι τα ποδοκύτταρα εκκρίνουν το μεταλλαγμένο α3α4α5 τριμερές στη ΣΒΜ αλλά αυτό πιθανότατα στη συνέχεια διασπάται. Η αποτελεσματική έκκριση των μεταλλαγμένων τριμερών μορίων κολλαγόνου IV στη ΣΒΜ πιθανώς να σχετίζεται με τον ηπιότερο φαινότυπο που παρουσιάζουν τα δύο αυτά μοντέλα ποντικού σε σχέση με τον Col4α3 knockout ποντικό που περιγράφηκε στο παρελθόν. Φαίνεται ότι η παρουσία του ελαττωματικού α3α4α5 τριμερούς “σώζει” εν μέρει το φαινότυπο σε σχέση με την πλήρη απουσία του από τη ΣΒΜ. Επιπρόσθετα, έγινε στρατολόγηση Κύπριων ασθενών με ετερόζυγες μεταλλάξεις στα COL4A3/COL4A4 γονίδια και ΝΛΒΜ και πλήρης κλινικο-εργαστηριακός χαρακτηρισμός τους, σε δύο χρονικά σημεία με διαφορά 2,5 ετών μεταξύ τους. Έγινε ταξινόμηση των ασθενών ανάλογα με το στάδιο σοβαρότητας της νόσου τους, με βάση την παρουσία επηρεασμένης νεφρικής λειτουργίας ή/και κλινικά σημαντικής πρωτεϊνουρίας. Επιβεβαιώθηκε για άλλη μια φορά ότι στον κυπριακό πληθυσμό η ΝΛΒΜ δεν αποτελεί μία καλοήθη νόσο και ότι η νεφρική αυτή οντότητα χαρακτηρίζεται από αργή εξέλιξη, παρέχοντας το περιθώριο για θεραπευτική παρέμβαση. Παράλληλα, από τους εν λόγω ασθενείς έγινε συλλογή αίματος προς απομόνωση DNA, ορού και πλάσματος και συλλογή ούρων. Το βιολογικό υλικό φυλάχθηκε στη Βιοτράπεζα του Πανεπιστημίου Κύπρου και σε συνδυασμό με τον άρτιο φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των ασθενών, αναδεικνύεται πολύτιμο για μελλοντική ανεύρεση τροποποιητικών γονιδίων και διαγνωστικών/προγνωστικών βιοδεικτών.

Alport syndrome (AS) is a hereditary nephritis leading inevitably to end stage renal disease. Until today there is no effective treatment for it. It is attributed to mutations in the COL4A3, COL4A4 and COL4A5 genes, coding for α3, α4 and α5 chains of collagen type IV respectively. Collagen type IV is one of the main components of the glomerular basement membrane (GBM). 85% of AS cases show an X-linked type of inheritance and 15% an autosomal recessive one. Heterozygous carriers of the autosomal recessive AS have Thin Basement Membrane Nephropathy (TBMN). Collagen IV diseases are characterized by significant genetic and phenotypic heterogeneity. Despite the fact that most of the mutations causing AS are missense mutations, a detailed phenotypic analysis of a knockin mouse model for AS is absent from the literature. In this study we present a thorough analysis of two AS mouse models. The first one is a knockin model carrying the Col4α3-p.G1332E missense mutation and the second one is a compound heterozygous model carrying the Col4α3-p.G1332E and a Col4α3 knocked out allele. This mutation is the homologous of the COL4A3-p.G1334E in humans, which is very frequent among the Cypriot heterozygous carriers of COL4A mutations, as a result of a founder effect. Furthermore, many AS patients are compound heterozygotes for mutations in the COL4A3, COL4A4 and COL4A5 genes. The findings from the two mouse models are compatible with AS kidney characteristics (reduced survival, impaired biochemical markers in blood and urine indicative of kidney disease, histological findings of increased fibrosis of the glomeruli and tubulointerstitial tissue and the pathognomonic ultrastructural findings of the GBM). Of special interest are the findings from the immunofluorescence studies on kidney sections and western blot results, where it is shown that the podocytes effectively secrete the mutant α3α4α5 protomer to the GBM, which is then probably cleaved. The effective secretion of the mutant type IV collagen molecules to the GBM is probably associated with the milder phenotype exhibited by the two mouse models compared to the Col4α3 knockout model described in the past. It seems that the presence of the defective α3α4α5 partly “rescues” the phenotype compared to the total absence of it from the GBM. Additionally, recruitment of Cypriot patients with heterozygous COL4A3/COL4A4 mutations and TBMN was performed. These patients were fully characterized based on clinical and laboratory findings at two time points, 2,5 years apart. Furthermore, a classification of their kidney disease severity was done based on the presence of impaired kidney function and/or clinically significant proteinuria. Once more it was confirmed that TBMN in Cypriots is not a benign condition and its’ progression is slow, giving the chance for therapeutic interventions. In parallel, blood for DNA, serum and plasma isolation was collected as well as urine samples. The biological material was stored at the Biobank of the University of Cyprus. Combined with the meticulous phenotypic analysis of the TBMN patients, this material proves to be valuable for future use in finding modifier genes and diagnostic/prognostic biomarkers.