Ανάλυση πολυφαινολών σε δείγματα χαρουπιού με χρήση φασματοφωτομετρικών, ηλεκτροφορητικών και χρωματογραφικών τεχνικών – Επίδραση παραγόντων στη φαινολική τους σύνθεση
![Thumbnail](/bitstream/handle/7/65364/Atalanti_Christou_PhD.pdf.jpg?sequence=2&isAllowed=y)
View/ Open
Date
2021-12Author
Χρίστου, Αταλάντη Χ.Publisher
Πανεπιστήμιο Κύπρου, Σχολή Θετικών και Εφαρμοσμένων Επιστημών / University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied SciencesPlace of publication
ΚύπροςGoogle Scholar check
Keyword(s):
Metadata
Show full item recordAbstract
Τα τελευταία χρόνια, η πολυφαινολική σύσταση των χαρουπιών έχει προσελκύσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον εξαιτίας των πολυάριθμων βιολογικών και ευεργετικών τους ιδιοτήτων. Βασικός στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μιας βέλτιστης και κατάλληλης μεθόδου για την ανάκτηση, τον καθαρισμό και την ανάλυση των πολυφαινολικών ενώσεων που περιέχονται στα χαρούπια και στα παράγωγα προϊόντα τους.
Σε πρώτο στάδιο, υπό τις συνθήκες αυτές, έλαβε χώρα η βελτιστοποίηση μιας μη συμβατικής μεθόδου εκχύλισης και πιο συγκεκριμένα, της εκχύλισης υποβοηθούμενης από υπερήχους (ultrasound-assisted extraction, UAE). Μέσω της μεθοδολογίας επιφανειών απόκρισης (response surface methodology, RSM) κατέστη δυνατή η μελέτη της επίδρασης του λόγου στερεού-διαλύτη, της συγκέντρωσης του διαλύτη, του χρόνου εκχύλισης, του πλάτους των υπερήχων και του τρόπου λειτουργίας των υπερήχων στην ικανότητα εξαγωγής των πολυφαινολικών ενώσεων, με ταυτόχρονο προσδιορισμό του ολικού φαινολικού περιεχομένου των εκχυλισμάτων (total phenolic content, TPC). Σε σχέση με τις κλασσικές διεργασίες εκχύλισης, η προτεινόμενη βέλτιστη μέθοδος εξαγωγής προσέφερε υψηλότερες αποδόσεις σε σημαντικά μειωμένους χρόνους επεξεργασίας.
Ακολούθως, αναπτύχθηκε μια απλή, γρήγορη και αξιόπιστη ηλεκτροφορητική μέθοδος ανάλυσης, με χρήση του συστήματος της ηλεκτροφόρησης τριχοειδούς (capillary electrophoresis, CE) σε σύζευξη με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων (diode array detection, DAD), για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των 12 πιο συχνά απαντώμενων στη σάρκα και στους σπόρους των χαρουπιών πολυφαινολικών ενώσεων. Έχοντας ως στόχο τον πλήρη διαχωρισμό των υπό μελέτη αναλυτών, παράγοντες όπως ο τύπος και η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος, η παρουσία προσθέτων και η εφαρμοζόμενη τάση, μελετήθηκαν λεπτομερώς. Η χρήση της β-κυκλοδεξτρίνης (β-cyclodextrin, β-CD) και του ιοντικού υγρού (ionic liquid, IL), ως πρόσθετα στο ρυθμιστικό διάλυμα, μελετήθηκε για πρώτη φορά και επέτρεψε τον αποτελεσματικό διαχωρισμό των υπό μελέτη βιοδραστικών ουσιών. Παράλληλα, με σκοπό την απομάκρυνση των ανεπιθύμητων συστατικών των εκχυλισμάτων, πριν την ηλεκτροφορητική τους ανάλυση, έλαβε χώρα αξιολόγηση της εκχύλισης στερεάς-φάσης (solid-phase extraction, SPE), ως στρατηγικής καθαρισμού των εκχυλισμάτων. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση των βέλτιστα ληφθέντων εκχυλισμάτων, που ακολούθησε, επέτρεψε τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των κύριων φαινολικών συστατικών των εκχυλισμάτων της σάρκας των ώριμων και άγουρων καρπών. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν την παρουσία του γαλλικού οξέος ως κύριου συστατικού, τόσο των ώριμων, όσο και των άγουρων καρπών, και υπογράμμισαν τη μεγάλη επίδραση του βαθμού ωρίμανσης των χαρουπιών στη φαινολική τους σύνθεση.
Στη συνέχεια, προτάθηκε η χρήση του συστήματος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (high-performance liquid chromatography, HPLC) σε σύζευξη με τη φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (high-resolution mass spectrometry, HRMS), ως μια πιο ευαίσθητη και εκλεκτική τεχνική, για την ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου των χαρουπιών και των παράγωγων προϊόντων τους. Συγκεκριμένα, κατά το τρίτο στάδιο της παρούσας μελέτης, αξιολογήθηκε η επίδραση του βαθμού ωρίμανσης, της μεθόδου κατεργασίας και της γεωγραφικής προέλευσης των χαρουπιών στη φαινολική τους σύσταση μέσω μιας πλήρους στατιστικής ανάλυσης. Παράλληλα, μέσω της αξιολόγησης του φαινολικού περιεχομένου της σάρκας και των σπόρων των χαρουπιών, προσδιορίστηκε η κατανομή των εν λόγω ενώσεων κατά μήκος των καρπών. Όσον αφορά την αξιολόγηση της επίδρασης της γεωγραφικής προέλευσης των χαρουπιών στην πολυφαινολική τους σύσταση, χρησιμοποιήθηκε μια πολυμεταβλητή στατιστική προσέγγιση με σκοπό τη μελέτη της σχέσης μεταξύ του φαινολικού περιεχομένου των χαρουπιών και της γεωγραφικής τους προέλευσης. Polyphenols in carobs have recently attracted great attention due to their wide range of biological and health-promoting effects. A comprehensive study was conducted to find an optimum method for the extraction, purification, and characterization of these valuable bioactive substances in carobs and their derived products.
Under this framework, the ultrasound-assisted extraction (UAE) of polyphenols was optimized by the maximization of the yield in total phenolics using response surface methodology (RSM). In particular, the effects of solid-solvent ratio, solvent concentration, extraction time, sonication amplitude, and sonication mode were investigated and optimized using a complete experimental design. In comparison to conventional extraction techniques, UAE offered a higher yield of antioxidants and a shorter processing time.
Then, a simple, reliable, and fast capillary electrophoretic method (capillary electrophoresis-diode array detector, CE-DAD) was developed and validated for the simultaneous determination of 12 polyphenolic compounds, the most frequently found in carob’s pulp and seeds. Several parameters, which affect the separation, were investigated in order to determine the optimum separation conditions. These include background electrolyte (BGE) concentration and pH, addition of organic solvents and other modifiers, and applied voltage. The present work deals with the development of a novel dual electrophoretic system based on the combined use of β-cyclodextrin (β-CD) and ionic liquid (IL) as buffer additives. Solid-phase extraction (SPE) was evaluated as a clean-up strategy prior to the electrophoretic analysis of extracts. The application of the developed electrophoretic method to real samples enabled the identification and quantification of the main phenolic constituents of both ripe and unripe carob pulp extracts. The results revealed the predominance of gallic acid in both ripe and unripe carob pulp and highlighted the great influence of the ripening stage on carobs polyphenolic composition.
The phenolic profiles of carobs and carob-based products were, then, analyzed by the use of high-performance liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS), which is a more sensitive and selective technique. In particular, the effects of the ripening stage, processing method, and geographical origin on carobs phenolic composition were investigated through the analysis of carobs and derived products by the use of HPLC-HRMS, combined with a complete statistical analysis. In addition, through the characterization of the phenolic pattern of different carob parts, the distribution of secondary metabolites across the fruit was also established. As far as the evaluation of the effect of geographical origin to the polyphenolic content is concerned, a multivariate statistical approach was employed to study the relationship between the phenolic composition of carobs and their growing regions.