Molecular cloning and functional characterization of Xenopus Laevis Nucleotide Binding Protein 1 (xNUBP1) during early embryonic development

Abstract

Η Nubp1 (Nucleotide binding protein 1) είναι μια συντηρημένη ΑΤΡάση (τύπου P-loop) που συμμετέχει σε διάφορες διαδικασίες όπως το σχηματισμό των πρωτεϊνών σιδήρου-θείου, το διπλασιασμό του κεντροσωματίου και την ανάπτυξη των πνευμόνων και των άκρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ξεκάθαρα ότι η Nubp1 είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου. Εντούτοις, οι περισσότερες μελέτες έχουν διεξαχθεί in vitro. Για την απάντηση σημαντικών ερωτημάτων που αφορούν το πώς και γιατί η Nubp1 είναι τόσο σημαντική, δεν αρκεί η in vitro μελέτη σε κυτταρικό επίπεδο αλλά απαιτούνται in vivo μελέτες σε επίπεδο οργανισμού. Ο βασικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν η κλωνοποίηση, έκφραση και χαρακτηρισμός της λειτουργίας της Nubp1 στον Xenopus laevis (xNubp1). Η χρήση του Xenopus laevis, σαν οργανισμό μοντέλο, είναι ιδανική για την ταυτοποίηση μεταγραφικών παραγόντων, δικτύων ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης καθώς και διακυτταρικών και ενδοκυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών υπεύθυνων για τη την πρώιμη ανάπτυξη. Επομένως, έγινε δυνατή η παρατήρηση του εντοπισμού της xNubp1 σε επίπεδο ζωντανού οργανισμού χρησιμοποιώντας εξελιγμένα συστήματα απεικόνισης και η τροποποίηση των επιπέδων έκφρασης της xNubp1 (με πειράματα κέρδους και απώλειας της λειτουργίας) πετυχαίνοντας τη κατανόηση της λειτουργίας της xNubp1κατά την ανάπτυξη των σπονδυλωτών in vivo. Έχουμε δείξει ότι η xNubp1 εκφράζεται μητρικά, συνδέεται με τους κυτταροσκελετούς ακτίνης και μικροσωληνίσκων, παρουσιάζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης σε νευρικούς ιστούς και είναι απαραίτητη σε σημαντικές διεργασίες κατά την εμβρυογένεση. Τα δεδομένα μας προτείνουν ότι η xNubp1 απαιτείται για τις κινήσεις της συγκλίνουσας επέκτασης και της κορυφαίας συστολής οι οποίες επιτελούνται κατά τη διάρκεια του κλεισίματος του νευρικού σωλήνα αλλά και για την επιμήκυνση των περιφερικών αισθητικών νευρώνων Rohon-beard. Επιπρόσθετα, η μείωση των επιπέδων έκφρασης της xNubp1 οδηγεί σε ανωμαλίες κατά τη δημιουργία των βλεφαρίδων στα πολυ-βλεφαριδοφόρα κύτταρα της επιδερμίδας καθώς και στα μονο-βλεφαριδοφόρα κύτταρα της οροφής του γαστρόκοιλου. Συγκεκριμένα, η xNubp1 απαιτείται για τη μετανάστευση, την αγκυροβόληση και τη σωστή τοποθέτηση των βασικών σωματίων στα πολυ-βλεφαριδοφόρα κύτταρα. Επιπλέον, είναι απαραίτητη για τη σωστή τοποθέτηση των βασικών σωματίων και την επιμήκυνση των αξονηματίων στα μονο-βλεφαριδοφόρα κύτταρα της οροφής του γαστρόκοιλου. Ζωντανή απεικόνιση της μετανάστευσης των βασικών σωματίων και των διαφορετικών πληθυσμών ακτίνης κατά τη διάρκεια της παρεμβολής των βλεφαριδοφόρων κυττάρων, έδειξε ότι δύο ανεξάρτητοι πληθυσμοί ακτίνης υπάρχουν από την έναρξη της παρεμβολής των κυττάρων: ένα εσωτερικό δίκτυο που περιβάλλει τα βασικά σωμάτια και τα αγκυροβολεί στον κυτταρικό φλοιό και ένας ανοργάνωτος πληθυσμός στην κορυφαία επιφάνεια του κυττάρου ο οποίος τελικά ωριμάζει δίνοντας το χαρακτηριστικό κορυφαίο δίκτυο ακτίνης. Τα αποτελέσματα μας δηλώνουν ότι η xNubp1 συνεντοπίζεται με το κορυφαίο δίκτυο ακτίνης των πολυ-βλεβαριδοφόρων κυττάρων και πώς τα προβλήματα μεταφοράς των βασικών σωματίων που παρουσιάζονται κατά την απώλεια της xNubp1 από τα κύτταρα (morphants) σχετίζονται με ανωμαλίες του εσωτερικού δικτύου ακτίνης. Από την άλλη, προβλήματα στην τοποθέτηση και πολικότητα των βασικών σωματίων οφείλονται στην αποτυχία του κορυφαίου και υπο-κορυφαίου πληθυσμού ακτίνης να ωριμάσουν σε οργανωμένα δίκτυα. Οι επιπτώσεις της μείωσης των επιπέδων της xNubp1 στον κυτταροσκελετό ακτίνης είναι ανεξάρτητες από τον εντοπισμό και την ενεργότητα της RhoA, υποδηλώνοντας ότι η xNubp1 πιθανών να έχει ένα άμεσο ρόλο στη ρύθμιση του κυτταροσκελετού ακτίνης.

Nucleotide binding protein 1 (Nubp1) is a highly conserved phosphate loop (P-loop) ATPase involved in diverse processes including iron-sulfur protein assembly, centrosome duplication and lung and limb development. Research conducted concerning the function of Nubp1 has focused mainly on its role as a scaffold in the cytosolic iron-sulfur protein assembly process. Previous research has clearly shown that Nubp1 is indispensible for normal cellular function; however, most of the studies conducted have been in vitro. In order to answer the important questions of how and why Nubp1 is so important, it is not enough to look in vitro at the cellular level; we must examine the role of Nubp1 in vivo at the level of the organism. The general aim of this project was the molecular cloning, expression and functional characterization of Xenopus laevis Nubp1. By using Xenopus laevis, a model organism which has paved the way for the identification of transcription factors, gene regulatory networks and inter- and intracellular signaling pathways that control early development, we have been able to observe xNubp1 localization live using sophisticated imaging systems, manipulate xNubp1 expression levels by overexpression and loss-of-function experiments, and have slowly begun to piece together the puzzle of the function of Nubp1 in vivo during vertebrate development. We show that xNubp1 is expressed maternally, is associated with actin and microtubule cytoskeletons, displays elevated expression in neural tissues and is essential during several key processes during development. Our data reveal that xNubp1 is required for convergent extension and apical constriction movements during neural tube closure and for Rohon-beard sensory neuron peripheral axon elongation. In addition, xNubp1knockdown leads to aberrant ciliogenesis of the multi-ciliated cells of the epidermis as well as the monociliated cells of the gastrocoel roof plate. Specifically, xNubp1 is required for basal body migration, spacing and docking in multi-ciliated cells and basal body positioning and axoneme elongation in monociliated gastrocoel roof plate cells. Live imaging of basal body migration and the different pools of actin during the process of ciliated cell intercalation revealed that two independent pools of actin are present from the onset of cell intercalation; an internal network surrounding the basal bodies, anchoring them to the cell cortex and an apical pool of punctate actin which eventually matures into the characteristic apical actin network. We show that xNubp1 colocalizes with the apical actin network of multiciliated cells and that problems in basal body transport in xNubp1 morphants are associated with defects of the internal network of actin, while spacing and polarity issues are due to a failure of the apical and sub-apical actin pools to mature into a network. These effects of xNubp1 knockdown on the actin cytoskeleton are independent of RhoA localization and activation, suggesting that xNubp1 may have a direct role in the regulation of the actin cytoskeleton.