Elucidation of the mechanism of prooxidant and cytotoxic activities of the olive secoiridoid oleuropein

Abstract

Η ικανότητα της πολυφαινόλης ολευροπαϊνης που συναντάται στο δέντρο της ελιάς όπως και του μεταβολίτη της υδροξυτυροσόλης να παράγουν υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας έχει ήδη καταδειχθεί από άλλους ερευνητές. Οι υπεύθυνες συνθήκες όμως καθώς κι ο συγκεκριμενος μηχανισμός της παραγωγής H2O2 παραμένουν άγνωστα. Πιο συγκεκριμένα, είναι άγνωστο αν η παραγωγή του H2O2 είναι αυστηρά εξαρτώμενη από τις χημικές ιδιότητες της ολευροπαϊνης, από τα συστατικά του θρεπτικού καλλιέργειας, από τις συνθήκες καλλιέργειας ή συνδιασμό αυτών. Είναι επίσης άγνωστο αν η κυτταροτοξική επίδραση του παραγόμενου H2O2 περιορίζεται στα καρκινικά κύτταρα ή επηρεάζει εξίσου και τα φυσιολογικά κύτταρα. Οι στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν να ταυτοποιήσουμε τις συγκεκριμένες συνθήκες που οδηγούν σε παραγωγή H2O2 από την ολευροπαϊνη και την υδροξυτυροσόλη, να προσδιορίσουμε αν τα καρκινικά κύτταρα είναι πιο ευάλωτα στην τοξική επίδραση του H2O2 και να διασαφηνίσουμε τον ακριβή μοριακό μηχανισμό κυτταρικού θανάτου. Διερυνήσαμε την ικανότητα της ολευροπαϊνης να παράγει H2O2 στα πιο κοινώς χρησιμοποιούμενα θρεπτικά καλλιέργειας (DMEM, MEM και DMEM/F12). Αξιολογήσαμε επίσης τη συνεισφορά των συστατικών του ΜΕΜ στην παραγωγή του H2O2, όπως επίσης και την συνεισφορά των συνθηκών καλλιέργειας (pH). Επιπλέον, διερευνήσαμε βιοχημικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των επωασμένων με ολευροπαϊνη κυττάρων καθώς και τη συμβολή αποπτωτικών και νεκρωτικών πρωτεϊνων με στόχο να διαλευκάνουμε τον ακριβή μηχανισμό που οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο. Οι ακριβείς παράγοντες υπεύθυνοι για την παραγωγή H2O2 και οι συνθήκες που την προάγουν ή αναστέλλουν, είναι σημαντικοί για την επεξήγηση των in vitro αποτελεσμάτων. Σε αυτή τη μελέτη, μια συστηματική αξιολόγηση των συστατικών των θρεπτικών καλλιέργειας κατέδειξε ότι το διττανθρακικό νάτριο με την σταθεροποίηση του pH σε τιμές μεγαλύτερες του 7, είναι η καθοριστική αιτία για την παραγωγή H2O2 από την ολευροπαϊνη και τον μεταβολίτη της υδροξυτυροσόλη Το παραγόμενο H2O2 προκάλεσε εκτενή οξειδωτική βλάβη στο DNA και σημαντική μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα τόσο των καρκινικών (MDA-MB-231) όσο και των φυσιολογικών (MCF-10A, STO) κυττάρων. Το πυροσταφυλικό νάτριο το οποίο δεσμεύει και καταστρέφει το H2O2 καθώς και το αντιοξειδωτικό Ν ακέτυλ-κυστεϊνη (NAC) εμπόδισαν αυτά τα φαινόμενα. Επομένως, έχουμε ταυτοποιήσει τις συνθήκες καλλιέργειας που προωθούν την παραγωγή H2O2 από την ολευροπαϊνη και τον μεταβολίτη της υδροξυτυροσόλη, προκαλώντας επιδράσεις στα κύτταρα που παρερμηνεύονται σαν εξειδικευμένη αντικαρκινική δράση. Τα αποτελέσματα μας εγείρουν σημαντικά ερωτήματα σχετικά με τη χρήση θρεπτικών υποστρωμάτων που περιέχουν διττανθρακικό νάτριο και πυροσταφυλικό νάτριο σαν συστατικά για την in vitro μελέτη των συγκεκριμένων αλλά και άλλων φυτικών πολυφαινολών. Επιπλέον έχουμε διαλευκάνει τον ακριβή μηχανισμό κυτταρικού θανάτου στην καρκινική σειρά μαστού MDA-MB-231. Η ολευροπαϊνη φάνηκε ότι ενεργοποιεί τις ΜΑPK κινάσες και την πρωτεϊνη PARP-1, με αποτέλεσμα την παραγωγή PAR πολυμερών και τη νέκρωση μέσω αποσταθεροποίησης της μιτοχονδριακής και λυσοσωμικής μεμβράνης. Ο κυτταρικός θάνατος φάνηκε να αναστέλλεται παρουσία της σιδηροδεσμευτικής ουσίας deferoxamine mesylate (DFO). O συγκεκριμένος μηχανισμός κυτταρικού θανάτου είναι κοινός στα κύτταρα που επωάζονται με H2O2. Τα αποτελέσματα μας, δίνουν μια ολοκληρωμένη περιγραφή της in vitro συμπεριφοράς της ολευροπαϊνης με λεπτομερή χαρακτηρισμό και επεξήγηση σε μοριακό επίπεδο της παρατηρούμενης κυτταροτοξικότητας. Τα αποτελέσματα μας επιτρέπουν στους ερευνητές να ελέγχουν τα παραγόμενα επίπεδα H2O2 κατά τον in vitro έλεγχο φυτικών πολυφαινολών και τη σχεδίαση πιο αξιόπιστων in vitro και in vivo μελετών.

The ability of the olive secoiridoid oleuropein and its metabolite hydroxytyrosol to produce hydrogen peroxide (H2O2) under standard culture conditions has been previously reported by others [1,2,3]. However, the exact conditions and the mechanism of H2O2 production remain unknown. Specifically, it is not known whether the H2O2 production is strictly dependent on the chemical properties of the compound, the culture media components, other cell culture conditions, or a combination of these. More importantly, it is unknown if the cell-killing effects of the olive polyphenol-generated H2O2 are limited to cancer cells, or affect equally normal cells. The aims of this study were to identify the precise conditions that lead to the H2O2 production by oleuropein and hydroxytyrosol, to determine if cancer cells are more susceptible to the deleterious effects of the produced H2O2 and elucidate the precise molecular mechanism of cell death. We have explored the capacity of oleuropein to produce H2O2 in the most commonly used culture media (i.e. DMEM, MEM and DMEM/F12). We have also evaluated the contribution of the MEM medium components to the production of H2O2, as well as the contribution of the culture conditions (i.e. pH). Moreover, the implication of many apoptotic and necrotic proteins were investigated in order to clarify the exact pathway that leads to cell death. The precise factors responsible for the H2O2 production and the conditions promoting or retarding it are critical for the interpretation of the in vitro results. In this study, a systematic evaluation of the components of the most commonly used culture media revealed that sodium bicarbonate by stabilizing the medium pH at values above 7, is the defining cause for the production of H2O2 by these phenols. The produced H2O2 caused extensive oxidative DNA damage and significant decrease in cell viability of cancer (MDA-MB-231) and normal (MCF-10A, STO) cells alike. Sodium pyruvate and the antioxidant N-acetyl cysteine (NAC) reversed these effects. Therefore, we conclusively identified the culture conditions that promote H2O2 production by these polyphenols, producing artifacts that may be misinterpreted as a specific anticancer activity. Our findings raise considerable questions regarding the use of culture media with sodium bicarbonate or sodium pyruvate as components, for the in vitro study of these and possibly other plant polyphenols. Furthermore, we have elucidated the exact molecular mechanism of cell death in the breast cancer cell line MDA-MB-231. Oleuropein was shown to promote the MAPK and PARP-1 activation, PAR production and necrosis through mitochondrial and lysosomal membrane destabilization. This mode of cell death is common in cells treated with H2O2. Our data give a complete description of the in vitro behavior of oleuropein with a detail characterization and explanation of the observed cytotoxicity in the molecular level. These results may enable cancer researchers to control the levels of H2O2 produced during the in vitro testing of plant polyphenols, and to design more meaningful in vitro and vivo studies.