Molecular and cellular investigation of glomerular filtration barrier components in thin basement membrane nephropathy

Abstract

Η Νεφροπάθεια της Λεπτής Βασικής Μεμβράνης (ΝΛΒΜ) και το σύνδρομο Alport αποτελούν κληρονομικές σπειραματοπάθειες, οι οποίες κατά κύριο λόγο οφείλονται σε μεταλλάξεις στα γονίδια COL4A3/A4/A5 τα οποία κωδικοποιούν για τις α3, α4 και α5 αλυσίδες αντίστοιχα του κολλαγόνου τύπου IV. Οι ασθενείς με σύνδρομο Alport παρουσιάζουν τυπικά μικροσκοπική ή/και μακροσκοπική αιματουρία από την παιδική ηλικία. Mε την πάροδο του χρόνου, η εξελισσόμενη νεφρική βλάβη οδηγεί σε πρωτεϊνουρία, έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας και αναπόφευκτα σε τελικό στάδιο νεφρικής ανεπάρκειας στη 2η-3η δεκαετία της ζωής. Η ΝΛΒΜ χαρακτηρίζεται τυπικά από μεμονωμένη μικροσκοπική αιματουρία σπειραματικής προέλευσης, απουσία κλινικά σημαντικής πρωτεϊνουρίας, φυσιολογική αρτηριακή πίεση και νεφρική λειτουργία. Ωστόσο, σημαντικός αριθμός δημοσιεύσεων αναφέρουν ότι ασθενείς με ΝΛΒΜ παρουσιάζουν σημαντική φαινοτυπική ετερογένεια, με κλινική εικόνα που ποικίλει ευρέως από μεμονωμένη μικροσκοπική αιματουρία μέχρι και τελικό στάδιο νεφρικής ανεπάρκειας σε ηλικίες πέραν των 40 ετών. Εντούτοις, τα ακριβή αίτια της ευρείας αυτής φαινοτυπικής ετερογένειας, καθώς επίσης και οι μοριακοί μηχανισμοί οι οποίοι ενεργοποιούνται σε έδαφος μεταλλάξεων στα γονίδια COL4A3/A4/A5 εξακολουθούν να παραμένουν άγνωστοι. Στην προσπάθεια εύρεση του μοριακού μηχανισμού ο οποίος οδηγεί στο σύνδρομο Alport ή στη ΝΛΒΜ, υποθέσαμε πως μεταλλάξεις στα γονίδια COL4A3/A4/A5, προκαλούν τη μη φυσιολογική ενεργοποίηση ενδοκυττάριων μονοπατιών, οδηγώντας στο συγκεκριμένο φαινότυπο. Για τη μελέτη αυτή έγινε υπερέκφραση της φυσιολογικής και της μεταλλαγμένης αλυσίδας του κολλαγόνου COL4A3 (μετάλλαξη COL4A3-p.G1334E) σε ανθρώπινα αδιαφοροποίητα ποδοκύτταρα προκειμένου να ελεγχθούν οι επιπτώσεις τους στα διάφορα ενδοκυττάρια μονοπάτια. Δεδομένα τα οποία προέκυψαν από σειρά πειραμάτων εισηγούνται πως η υπερέκφραση του κολλαγόνου COL4A3 οδηγεί σε ανώμαλη εντόπιση της συγκεκριμένης αλυσίδας στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ενεργοποιώντας το μονοπάτι των μη σωστά αναδιπλωμένων πρωτεϊνών (unfolded protein response-UPR). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε μοντέλο knockin ποντικού, το οποίο φέρει τη μετάλλαξη Col4a3-p.G1332E καθώς επίσης και σε βιοψίες ασθενών με ΝΛΒΜ οι οποίοι ήταν φορείς της μετάλλαξης COL4A3-p.G1334E. Επιπλέον, παρατηρώντας την ύπαρξη φαινοτυπικής ετερογένειας σε ασθενείς με ΝΛΒΜ, υποθέσαμε πως κάποια γονίδια μπορεί δυνητικά να δρουν ως τροποιητικά γονίδια. Πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση και αλληλούχηση γονιδίων τα οποία εκφράζονται στο σχισμοειδές διάφραγμα των ποδοκυττάρων για εντοπισμό επιβλαβών μη συνώνυμων πολυμορφισμών. Μετά από γονοτύπηση έξι υψηλού ρίσκου πολυμορφισμών σε 103 ασθενείς με ΝΛΒΜ, οι οποίοι είχαν κατηγοριοποιηθεί βάσει κλινικών κριτηρίων σε σοβαρά και ήπια επηρεασμένους ασθενείς, επισημάνθηκε ο συσχετισμός του πολυμορφισμού NEPH3-p.V353M με το σοβαρό φαινότυπο της ΝΛΒΜ (p=0.036). Ακολούθησε έλεγχος για το συγκεκριμένο πολυμορφισμό μεγαλύτερης συλλογής ασθενών με αιματουρία (HEMATURIA) η οποία αποτελείται από 524 ασθενείς, επίσης κατηγοριοποιημένους ως σοβαρά ή ήπια πάσχοντες. Και πάλι εντοπίστηκε η σχέση του πολυμορφισμού NEPH3-p.V353M με τη σοβαρότητα της πορείας της νόσου (p=3.0x10-3). Επιπλέον, ακολούθησε η γονοτύπηση 6,531 ατόμων από τη συλλογή Framingham Heart Study (FHS), η οποία αποκάλυψε τη συσχέτιση του ομόζυγου γονοτύπου 353M/M με τη μικροαλβουμινουρία (p=1.0x10-3). Δύο ανεξάρτητες πληθυσμιακές συλλογές, KORAF4 και SAPHIR, επιβεβαίωσαν το αποτέλεσμα αυτό ενώ μέτα-ανάλυση και των τριών συλλογών (11,258 άτομα) παρουσίασε αυξημένη στατιστική σημαντικότητα (p=1.3x10-5). Επιπρόσθετες λειτουργικές μελέτες παρουσίασαν την επίδραση του NEPH3-p.V353M στον ομοδιμερισμό και ετεροδιμερισμό της φιλτρίνης με τη νεφρίνη. Επίσης, χρήση πρωτεομικής ανάλυσης σε συνδυσμό με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης και ανοσοφθορισμού, επέτρεψαν την ταυτοποίηση της Myh9 ως νέου μορίου αλληλεπίδρασης με τη φιλτρίνη. Η παρουσία του πολυμορφισμού NEPH3-p.V353M είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντικότερη αλληλεπίδραση της φιλτρίνης με τη Myh9. Επίσης, υπερέκφραση της NEPH3-p.V353M στην παρουσία tunicamycin οδήγησε σε ένα διαφορετικό τρόπο ενεργοποίησης του μονοπατιού UPR. Επιπρόσθετα, αλληλούχηση του γονιδίου της ποδοσίνης οδήγησε στον εντοπισμό των πολυμορφισμών NPHS2-p.E237Q και NPHS2-p.R229Q σε επτά σοβαρά επηρεασμένους ασθενείς με ΝΛΒΜ. Οι ασθενείς αυτοί ανήκουν σε δυο διαφορετικές οικογένειες με χαρακτηριστικό γνώρισμα τη συγκληρονόμηση της μετάλλαξης COL4A3-p.G1334E. Πειράματα ανοσοφθορισμού ανέδειξαν μεταβολή στον εντοπισμό της φυσιολογικής ποδοσίνης ή νεφρίνης στην παρουσία των δύο πολυμορφισμών, εμφανίζοντας περιπυρηνική χρώση. Επιπλέον, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης παρουσίασαν ισχυρότερη σύνδεση των δύο μεταλλαγμένων μορφών της ποδοσίνης με τη φυσιολογική ποδοσίνη ή νεφρίνη. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το στρες στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το οποίο προκαλείται από το μη φυσιολογικό εντοπισμό των αλυσίδων του κολλαγόνου IV στα ανθρώπινα ποδοκύτταρα, συμβάλλει στην παθογένεση της ΝΛΒΜ και του συνδρόμου Alport μέσω της ενεργοποίηση του UPR. Ένα αρκετά υποσχόμενο εύρημα για την εφαρμογή καινοτόμων θεραπευτικών παρεμβάσεων για τις διάφορες κολλαγονοπάθειες. Τα αποτελέσματα τα οποία προέκυψαν από τις γενετικές και λειτουργικές μελέτες σε ότι αφορά στον πολυμορφισμό NEPH3-p.V353M ενισχύουν το σημαντικό ρόλο του σπάνιου αυτού πολυμορφισμού, ο οποίος φαίνεται να επιδρά αρνητικά στην εξέλιξη της αιματουρίας. Συμπληρωματικές γενετικές μελέτες παρουσίασαν ότι ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός σε ομοζυγωτία αποτελεί προδιαθεσικό παράγοντα για την ανάπτυξη μικροαλβουμινουρίας σε άτομα του γενικού πληθυσμού. Τέλος, γενετικές και λειτουργικές μελέτες υποστηρίζουν την άποψη ότι συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί οι οποίοι εντοπίζονται στην ποδοσίνη μπορούν να δράσουν ως τροποιητικά γονίδια, όταν συγκληρονομηθούν με μεταλλάξεις στα γονίδια COL4A3/A4, προδιαθέτοντας ίσως για FSGS και σοβαρότερο φαινότυπο.

Thin-basement-membrane nephropathy (TBMN) and Alport syndrome (AS) are hereditary collagen IV glomerulopathies caused by mutations in the COL4A3/A4/A5 genes. Clinical presentation of AS includes hematuria, progressive nephritis with proteinuria and declining renal function leading to end-stage renal disease. TBMN represents the carrier state of AS and is typically characterized by persistent microscopic hematuria of glomerular origin, minimal proteinuria, normal arterial blood pressure and normal renal function. However, scarce reports suggest that, occasionally, TBMN can be progressive, leading to impairment of renal function of variable degree causing even end-stage renal disease (ESRD). Nonetheless, the cause of this phenotypic variability observed in TBMN patients and the exact molecular mechanisms by which these mutations exert their deleterious effects on the glomerulus remain elusive. Therefore, it was hypothesized that defective trafficking of the COL4A3 chain causes a strong intracellular effect on the cell responsible for COL4A3 expression, the podocyte. To this end, normal and mutant COL4A3 chains (COL4A3-p.G1334E mutation) were overexpressed in human undifferentiated podocytes in order to verify their effects in various intracellular pathways employing a microarray approach. COL4A3 overexpression caused chain retention in the endoplasmic reticulum (ER) leading to the activation of unfolded protein response (UPR)–related markers of ER stress. Remarkably, the overexpression of normal or mutant COL4A3 chains differentially activated the UPR pathway. Similar results were observed in a novel knockin mouse carrying the Col4a3-p.G1332E mutation, which produced a phenotype consistent with AS and in biopsy specimens from patients with TBMN carrying a heterozygous COL4A3-p.G1334E mutation. Additionally, it was hypothesized that genetic modifiers could explain the observed variability of symptoms in TBMN patients. To this end, in silico analysis and re-sequencing in genes expressed in the slit diaphragm was performed, in an effort to detect potentially deleterious non-synonymous SNPs. Genotyping for six high-scored variants in 103 TBMN adult patients with founder mutations, who were classified as mildly or severely affected, pointed to an association with variant NEPH3-p.V353M (filtrin) (p=0.036). This result prompted testing in a larger pooled cohort (HEMATURIA) of 524 patients, which also included IgA nephropathy patients, categorized as “Severe” or “Mild”. This indicated an association of the NEPH3-p.V353M variant with disease severity under the dominant model (p=3.0x10-3). Subsequently, genotyping 6,531 subjects of the Framingham Heart Study (FHS) revealed an association of the homozygous 353M/M genotype with microalbuminuria (p=1.0x10-3). Two further general population cohorts, KORAF4 and SAPHIR confirmed the association, and a meta-analysis of all three cohorts (11,258 individuals) was highly significant (p=1.3x10-5). Moreover, functional studies exhibited a slight distortion in homodimerization or heterodimerization of Neph3 with nephrin caused by the NEPH3-p.V353M. Interestingly, a combination of a proteomics approach followed by immunoprecipitation and immunofluorescence experiments, identified Myh9 as a new interacting partner of filtrin. The filtrin NEPH3-p.V353M substitution resulted in a significantly stronger interaction with Myh9 protein. Additionally, overexpression of NEPH3-p.V353M in the presence of tunicamycin, exhibited a differential activation of the UPR pathway. Furthermore, resequencing of NPHS2 led to the detection of NPHS2-p.E237Q and NPHS2-p.R229Q in seven severely affected TBMN patients, belonging in two families, which segregated mutation COL4A3-p.G1334E (combined concordance probability 0,003). Immunofluorescence experiments suggested altered localization of wt podocin or nephrin when co-expressed with each of the two these variants, demonstrating perinuclear staining. Additionally, immunoprecipitation experiments showed stronger binding of mutant podocin to wt podocin or nephrin. These results suggest that ER stress arising from defective localization of collagen IV chains in human podocytes contributes to the pathogenesis of TBMN and AS through activation of the UPR, a finding that may pave the way for novel therapeutic interventions for a variety of collagenopathies. Moreover, genetics and functional studies support a “rare variant-strong effect” role for NEPH3-p.V353M, by exerting a negative modifier effect on primary hematuria. Additionally, genetics studies support a role in predisposing homozygous subjects of the general population to micro-albuminuria. Finally, genetics and functional studies support the hypothesis that certain hypomorphic podocin variants may act as adverse modifiers when co-inherited with COL4A3/A4 mutations, thus predisposing to FSGS and severe kidney function decline. Overall, the current study, using an interdisciplinary approach, shed light to the pathophysiology of TBMN, a serious health issue in Cyprus and around the world.