The role of Calpain2 during vertebrate embryonic development

Abstract

Οι Calpains είναι μια οικογένεια ασβεστο-εξαρτώμενων πρωτεασών που ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες μέσω περιορισμένης πρωτεόλυσης διάφορων υποστρωμάτων. Ο ρόλος της Calpain2 στην εμβρυογένεση δεν είναι ξεκάθαρος αφού τα δεδομένα από knock-out ποντίκια είναι αντιφατικά. Σε αυτή τη μελέτη αναφέρουμε τη χρονική και τοπική έκφραση της Calpain2 σε έμβρυα Xenopus laevis και μελετάμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του Xenopus. Δείχνουμε ότι η Calpain2 εκφράζεται μετρικά με αυξημένα επίπεδα έκφρασης στους νευρικούς ιστούς και η ενεργοποίηση της Calpain2 ρυθμίζεται χρονικά και τοπικά. Περαιτέρω δείχνουμε ότι η Calpain2 ενεργοποιείται μέσω του μονοπατιού Wnt/Ca2+ . και η ενεργοποίηση της εξαρτάται από την ενεργότητα της Dishevelled κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του Xenopus. Μπλοκάροντας τη δράση της Calpain ή μετά από μείωση των επιπέδων έκφρασης της δείχνουμε ότι η Calpain2 είναι απαραίτητη για τη μορφογένεση. Συγκεκριμένα η Calpain2 εμπλέκεται στη συγκλίνουσα επέκταση (Convergent Extension) σε μεσοδερμικούς όσο και σε νευρικούς ιστούς και μείωση των επιπέδων έκφρασης της οδηγούν σε ελαττωματικό κλείσιμο του βλαστοπόρου και του νευρικού σωλήνα. Αυτοί οι φαινότυποι αποδίδονται σε απώλεια της πολικότητας του ιστού που οδηγεί σε προβληματική μεσοπλευρικής παρένθεσης όπως δείχνουν μοσχεύματα Keller. Επιπρόσθετα αναγνωρίζουμε την Calpain2 σαν ένα νέο ρυθμιστή της κορυφαίας στένωσης (Apical Constriction), δείχνοντας ότι μείωση της έκφρασης της οδηγεί σε ανωμαλίες του εμπρόσθιου νευρικού σωλήνα λόγω προβληματικής κορυφαίας στένωσης των νευροεπιθηλιακών κυττάρων. Επιπρόσθετα δείχνουμε ότι η Calpain2 είναι απαραίτητη στην οργανογένεση που εξαρτάται από την κορυφαία στένωση δείχνοντας ότι η Calpain2 εμπλέκεται στην κορυφαία στένωση ανεξαρτήτως ιστού. Χρησιμοποιώντας υψηλής ανάλυσης απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο δείχνουμε ότι η κορυφαία στένωση κατά τη διάρκεια του κλεισίματος του νευρικού σωλήνα στο Xenopus είναι μια σταδιακή διαδικασία που οδηγείται από κυτταρικά αυτόνομες και ασύγχρονες παλμικές συστολές που ακολουθούνται από βήματα σταθεροποίησης. Επιπρόσθετα τα δεδομένα μας προτείνουν ότι οι συστολές ενεργοποιούνται από κυτταρικά αυτόνομούς παλμούς ενδοκυττάριου ασβεστίου και ελέγχονται από ένα κορυφαίο συσταλτικό σύμπλοκο ακτίνης. Επιπρόσθετα παραθέτουμε δεδομένα που υποστηρίζουν ότι η αυτονομία και η ασυγχρονία των παλμικών συστολών είναι απαραίτητες για τη σωστή κατανομή της κορυφαίας στένωσης και ως αποτέλεσμα είναι απαραίτητες για σωστή μορφογένεση του ιστού. Τέλος, δείχνουμε ότι η Calpain2 εμπλέκεται μόνο στο βήμα σταθεροποίησης κατά τη κορυφαία στένωση.

Calpains are a family of calcium-dependent intracellular cysteine proteases that regulate several physiological processes through limited cleavage of different substrates. The role of Calpain2 in embryogenesis is not clear with conflicting evidence from a number of mouse knockouts. Here we report the temporal and spatial expression of Calpain2 in Xenopus laevis embryos and address its role in Xenopus development. We show that Calpain2 is expressed maternally with elevated expression in neural tissues and that Calpain2 activity is spatially and temporally regulated. We further show that Calpain2 is activated in response to Wnt/Ca2+ pathway in a Dishevelled depended manner during Xenopus development. Using a Calpain inhibitor, a dominant negative and a morpholino oligonoucleotide we demonstrate that Calpain2 is necessary for proper morphogenesis. Specifically Calpain2 is implicated in Convergent Extension both in mesodermal and neural tissues and its downregulation results in defective blastopore and neural tube closure. These phenotypes are attributed to loss of tissue polarity and blockage of mediolateral intercalation as shown by Keller (mesodermal) explants. Furthermore, we identify Calpain2 as a novel regulator of Apical Constriction. Notably, we show that Calpain2 downregulation results in rostral Neural Tube Defects due to defective Apical Constriction of neuroepithelial cells. We further demonstrate that Calpain2 function is necessary in Apical Constriction driven organogenesis showing that Calpain2 is implicated in Apical Constriction independently of the tissue context. Using high resolution live imaging we demonstrate that Apical Constriction during Xenopus neural tube closure is a stepwise process driven by cell autonomous and asynchronous contraction pulses followed by stabilization steps. In addition our data suggest that contraction events are triggered by cell autonomous Ca²+ flashes and are driven by a transient contractile apical pool of actin. In addition we provide evidence that the cell autonomy and asynchrony of contraction are required for the correct spatial distribution of Apical Constriction and as a result are critical for tissue morphogenesis. Finally we show that Calpain2 is specifically required for the stabilization step during Apical Constriction but is dispensable during contraction.