H KATNAL2, μια πρωτεΐνη τύπου κατανίνης, συμμετέχει στην μεταγραφή του ριβοσωμικού RNA και αλληλοεπιδρά λειτουργικά με τον κορυφαίο μεταγραφικό παράγοντα UBF, του οποίου η αποσιώπηση προκαλεί απορρύθμιση του δικτύου μεταγραφής των ριβοσωμικών γονιδίων σε κύτταρα ποντικού

Abstract

Η βιογένεση των ριβοσωμάτων αποτελεί πολύπλοκη διαδικασία κατά την οποία μεταγράφεται και τυγχάνει επεξεργασίας το πρόδρομο ριβοσωμικό RNA (rRNA), τα προϊόντα του οποίου τελικά ενσωματώνονται κατά τη συναρμολόγηση των λειτουργικών ριβοσωμικών υπομονάδων. Δυσλειτουργίες στην παραγωγή ριβοσωμάτων οδηγούν σε ασθένειες, τις ριβοσωμοπάθειες, συνεπώς, υπάρχει συνεχές ενδιαφέρον για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τις διαδικασίες αυτές. Προηγούμενη έρευνα του εργαστηρίου μας ανακάλυψε και χαρακτήρισε την πρωτεΐνη τύπου κατανίνης ΚΑΤΝΑL2 ως ένα πολυλειτουργικό ένζυμο που εντοπίζεται στους μικροσωληνίσκους και τα κεντροσωμάτια, εμπλέκεται στην κυτοκίνηση, την βλεφαριδογένεση και την δυναμική των μικροσωληνίσκων, επηρεάζοντας ταυτόχρονα και τον κυτταρικό κύκλο ζωής σε κύτταρα ποντικού1. Παράλληλα, τεκμηριώθηκε ότι η ΚΑΤΝΑL2 εμπλέκεται στην οργανογένεση των σπονδυλοζώων2. Στη διδακτορική αυτή μελέτη, εντοπίσαμε την ΚΑΤΝΑL2, επιπλέον, στον πυρηνίσκο των κυττάρων, το πυρηνικό διαμέρισμα όπου διενεργείται η συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων. Ειδικότερα, παρατηρήσαμε ότι η ΚΑΤΝΑL2 συν-εντοπίζεται στον πυρηνίσκο με πρωτεΐνες που έχουν καθιερωμένο ρόλο στη μεταγραφή και μέτα-μεταγραφική επεξεργασία των ριβοσωμικών γονιδίων, όπως είναι ο μεταγραφικός παράγοντας UBF και η μεθυλτρανσφεράση fibrillarin. Αξίζει να σημειωθεί ότι είναι η πρώτη φορά που πρωτεΐνη τύπου κατανίνης εντοπίζεται στον πυρηνίσκο. Παρόλο που έχει μελετηθεί εκτενώς η διαδικασία μεταγραφής και επεξεργασίας του rRNA και έχει καθιερωθεί ότι ο κορυφαίος ρόλος του UBF, εδώ, έχουμε δείξει ότι μια πρωτεΐνη τύπου κατανίνης εμπλέκεται σε αυτή τη διαδικασία και είναι μάλιστα ικανή να επηρεάσει τόσο τα πρωτεϊνικά επίπεδα του UBF, όσο και άλλων σημαντικών παραγόντων του δικτύου της διαδικασίας. Συγκεκριμένα, κατά τη μεταγραφική αποσιώπηση (silencing) της ΚΑΤΝΑL2, διενεργήσαμε ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών επιπέδων παραγόντων που συμμετέχουν στη δημιουργία του προεκκινητικού συμπλέγματος της μεταγραφής του rRNA, του UBF και της ενεργοποιημένης μορφής του pUBF (Ser484), του παράγοντα RRN3 και της ίδιας της πολυμεράσης POLR1, καθώς και των ενζύμων της μέτα-μεταγραφικής επεξεργασίας του rRNA TCOF1 και fibrillarin. Αυτή έδειξε ότι μειορυθμίζονται σημαντικά. Επιπρόσθετα, η αποσιώπηση της KATNAL2 φαίνεται να επηρεάζει την ενσωμάτωση του FUrd στο νεοσυντιθέμενο rRNA, και ενδεχομένως την επεξεργασία του πρόδρομου rRNA. Η εμπλοκή της KATNAL2 στη μεταγραφή του rRNA αποτέλεσε ενδιαφέρον εύρημα και η μείωση της έκφρασης του UBF υπό συνθήκες αποσιώπησής της έδωσε το έναυσμα για περαιτέρω μελέτη της λειτουργικής σχέσης μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάστηκαν μόνιμα αποσιωπημένες για τον UBF κυτταροσειρές. Συμπληρωματικά με τον ήδη γνωστό ρόλο του UBF στην διαμόρφωση της χρωματίνης στο rDNA και στην προώθηση της μεταγραφής, δείξαμε ότι η αποσιώπησή του διαταράσσει την έκφραση ενός ευρύτερου ανοδικού και καθοδικού δικτύου πρωτεϊνών που ρυθμίζουν τη μεταγραφή του rRNA και την έκβαση σηματοδοτικών μονοπατιών αύξησης, αναδεικνύοντας ακόμη περισσότερο τη σημασία του στη μεταγραφή του rRNA. Ειδικότερα, ανακαλύψαμε ότι η αποσιώπηση ενός και μόνο παράγοντα, του UBF, είναι ικανή να επηρεάσει αρνητικά σηματοδοτικά μονοπάτια ανοδικά από αυτόν, όπως είναι το mTOR, το οποίο ρυθμίζει και τη μεταγραφή του rRNA. Ταυτόχρονα, επηρεάζει αρνητικά τα πρωτεϊνικά επίπεδα της KATNAL2, της fibrillarin, και της TCOF1, γεγονός που ενισχύει το εύρημα για τη μεταξύ τους λειτουργική σχέση. Είναι γνωστό ότι εξωγενή σήματα ανάπτυξης, όπως τα θρεπτικά υλικά, επηρεάζουν καθοριστικά τη μεταγραφή του rRNA. Kατ’ επέκτασιν, καταμετρήσαμε και δείξαμε ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα του pUBF και του μεταγραφικού παράγοντα RRN3 είναι μειωμένα στους αποσιωπημένους για τον UBF κλώνους και ανταποκρίνονται ευθέως στις αυξανόμενες συνθήκες ορού στο θρεπτικό υλικό. Ο μέχρι σήμερα αποδεδειγμένος τρόπος ρύθμισης της μεταγραφής από την POLR1 πραγματοποιείται μέσω της πρόσδεσής της στους υποκινητές των ριβοσωμικών γονιδίων. Στην μελέτη αυτή, δείξαμε ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα της υπομονάδας της POLR1, POLR1E, εντοπίζονται μειωμένα και αυξάνονται με την αύξηση της συγκέντρωσης του ορού σε συνθήκες αποσιώπησης του UBF έτσι, προτείνουμε ένα νέο τρόπο ρύθμισης της μεταγραφής διαμέσου της μείωσης της έκφρασης της POLR1. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας προσφέρουν νέα γνώση στο πεδίο της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, εμπλέκοντας την KATNAL2 στη μεταγραφή/επεξεργασία του rRNA και υποστηρίζοντας παράλληλα τη στενή αλληλεπίδραση της με τον UBF. Τα νέα μας ευρήματα συνεισφέρουν στη διεύρυνση της κατανόησης των βασικών μηχανισμών βιοσύνθεσης του rRNA μιας διαδικασίας ζωτικής σημασίας για το κύτταρο. Μέρος της διατριβής έχει δημοσιευτεί ως ακολούθως: Theophanous A, Christodoulou A, Mattheou C, Sibai DS, Moss T, Santama N. Transcription factor UBF depletion in mouse cells results in downregulation of both downstream and upstream elements of the rRNA transcription network. J Biol Chem. 2023 Sep 1;299(10):105203. doi: 10.1016/j.jbc.2023.105203. Epub ahead of print. PMID: 37660911.

1Ververis et al., 2016 2Willsey et al., 2018

Ribosome biogenesis is a multi-step process which includes the transcription and processing of pre-ribosomal RNA (rRNA) and the assembly of the mature products into functional ribosomal subunits. Dysregulation in ribosome production can lead to diseases, called ribosomopathies. It its therefore of high importance to study the molecular mechanisms underlying these processes. Previous work in our lab identified and characterised a katanin-like protein, KATNAL2, as a multi-tasking enzyme localized at microtubules and centrosomes, implicated in cytokinesis, ciliogenesis and microtubule dynamics, and affecting at the same time the cell cycle in mouse cells1. In parallel, it was established that KATNAL2 is implicated in vertebrate organogenesis2. Is this study, we identified KATNAL2, in addition, in the cell nucleolus, the nuclear sub-compartment where ribosome assembly occurs. In particular, we demonstrated that KATNAL2 is co-localised in the nucleolus with proteins with established roles in transcription and post-transcriptional processing of ribosomal genes, for example the transcription factor UBF and the methyltransferase fibrillarin. Notably, it is the first time for a katanin-like protein to be identified in the nucleolus. Even though the transcription of rRNA and the role of UBF as a master regulator are well established, here we showed that a katanin-like protein is implicated in the aforementioned procedure. We demonstrated that KATNAL2 depletion is sufficient to affect protein levels of UBF as well as of other important factors of the rRNA transcription/processing network. In particular, upon KATNAL2 silencing, we quantified the protein levels of UBF and other main regulators which are components of pre-initiation complex of rRNA transcription, for example UBF and its activated pUBF (Ser484) form, factor RRN3 and RNA POLR1, as well as factors implicated in rRNA post-transcriptional processing, such as TCOF1 and fibrillarin and showed that are all severely downregulated. Moreover, we found that KATNAL2 silencing affects FUrd incorporation in newly transcribed rRNA and may affect post-transcriptional processing of rRNA. Given the newly characterized role of KATNAL2 in rRNA transcription and the downregulation of UBF upon KATNAL2 silencing, we then studied further their functional correlation by generating UBF silenced cell lines. In addition to the previously established role of UBF in rDNA chromatin remodelling and in promoting rRNA transcription, here we uncovered that UBF silencing disrupts protein expression of a wider network of both downstream and upstream factors related to rRNA transcription and upstream growth signaling pathways, underlying further the importance of UBF in this procedure. Specifically, we discovered that UBF silencing alone, can negatively affect upstream signaling pathways, for example the mTOR, which regulates rRNA transcription and protein synthesis. At the same time, UBF silencing negatively affected protein levels of KATNAL2, fibrillarin and TCOF1, further strengthening their functional relationship. It is known that external growth signals, such as nutrients, affect rRNA transcription. Here, we demonstrated that the protein levels of pUBF and transcription factor RRN3 are downregulated upon UBF silencing and are responsive to extracellular growth factors. Transcriptional rates can be regulated via modulation of POLR1 binding to the rDNA promoters. In this study, we showed that protein levels of POLR1 subunit, POLR1E, are downregulated and increased proportionally to serum when UBF is silenced, suggesting a new mode of rRNA transcription modulation through the downregulation of POLR1 itself. Overall, our data extend the knowledge in the field of ribosome biogenesis, implicating KATNAL2 in rRNA transcription/processing and highlighting at the same time its functional association with UBF. Our results broaden the understanding of the basic mechanisms governing rRNA biosynthesis, a vital process for cellular growth and survival. Part of this dissertation has been published as follows: Theophanous A, Christodoulou A, Mattheou C, Sibai DS, Moss T, Santama N. Transcription factor UBF depletion in mouse cells results in downregulation of both downstream and upstream elements of the rRNA transcription network. J Biol Chem. 2023 Sep 1;299(10):105203. doi: 10.1016/j.jbc.2023.105203. Epub ahead of print. PMID: 37660911.

1Ververis et al., 2016 2Willsey et al., 2018