Time-resolved step-scan FTIR studies of heme-based oxygen sensor proteins

Abstract

Η ανακάλυψη και ο χαρακτηρισμός νέων αιμοπρωτεϊνών αισθητήρων κατά την τελευταία δεκαετία έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον για την κατανόηση του ρυθμιζόμενου από μια προσθετική ομάδα αίμης μηχανισμού αναγνώρισης και διάκρισης των διατομικών αέριων μορίων Ο2, NO και CO, που δρουν ως μόρια σηματοδότησης για πολλές βιολογικές διεργασίες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έχουμε χρησιμοποιήσει τη φασματοσκοπία FTIR και χρονικής ανάλυσης step-scan (TRS2) – FTIR, για τη διερεύνηση της δυναμικής και των δομικών αλλαγών που επιφέρονται στην πρωτεΐνη κατά τη φωτοδιάσπαση και επαναδέσμευση του αέριου υποκαταστάτη (CO), οι οποίες αποτελούν πληροφορίες “κλειδιά” για την κατανόηση του μηχανισμού ενδομοριακής μεταγωγής σήματος τριών αιμοπρωτεϊνών αισθητήρων οξυγόνου (HemAT-Bs, YddV και EcDOS). Έχουμε μελετήσει τα σύμπλοκα “αγρίου τύπου” HemAT-CΟ τόσο της άθικτης μορφής της πρωτεΐνης, όσο και της απομονωμένης περιοχής ανίχνευσης, καθώς επίσης και των μεταλλαγμένων Y70F, Y133F, L92A και T95A πρωτεϊνών. Προτείνουμε σημαντική αλλαγή προσανατολισμού για τις Β- και G- έλικες κατά τη δέσμευση του CO. Επιπλέον, η ανίχνευση δευτερευόντων θέσεων δέσμευσης του υποκαταστάτη στα TRS2-FTIR φάσματα (td = 300 ns) της αγρίου τύπου πρωτεΐνης και της μετάλλαξης L92Α υποδηλώνει το ρόλο του καταλοίπου Leu92 ως πύλη στη διαδρομή του φωτοδιασπώμενου CO από/προς το κέντρο της αίμης. Έχουμε πραγματοποιήσει πειράματα με φασματοσκοπία TRS2-FTIR τόσο στην αγρίου τύπου μορφή της YddV, όσον και στις σημαντικές για την αναγνώριση του Ο2 και τη σταθερότητα του Fe2+-O2 συμπλόκου μεταλλάξεις L65M, L65T, Y43A, Y43F και Y43W, για να καθορίσουμε τις δομικές αλλαγές στην περιοχή του ενεργού κέντρου της αίμης κατά τη φωτοδιάσπαση του CO. Τα TRS2-FTIR φάσματα διαφοράς έχουν υποδείξει ότι οι προπιονικές ομάδες της αίμης βρίσκονται τόσο στην πρωτονιομένη, όσο και στην αποπρωτονιομένη μορφή. Επιπλέον, η κινητική εξέλιξη των δονήσεων των προπιονικών ομάδων και του αμιδίου Ι συμπίπτει χρονικά με το ρυθμό επαναδέσμευσης του CO, προτείνοντας έτσι ότι υπάρχει σύζευξη μεταξύ της δέσμευσης του υποκαταστάτη με α) το περιβάλλον των προπιονικών ομάδων της αίμης και β) την αποδιεέγερση της πρωτεΐνης. Η κινητική επαναδέσμευσης του CO στις μεταλλάξεις L65M, L65T και Y43W, υποδηλώνει ότι τα κατάλοιπα Leu65 και Τyr43 ελέγχουν σημαντικά τη δυναμική του υποκαταστάτη. Τα TRS2- FTIR φάσματα διαφοράς της αγρίου τύπου EcDOSH κατά τη φωτοδιάσπαση του CO στα td = 6 μs, έχουν υποδείξει 55% παραγωγή φωτοπροϊόντος, με το υπόλοιπο 45% του CO να υπόκειται σε άμεση επανασύνδεση.. Μελετώντας την κινητική εξέληξη της επαναδέσμευσης του CO στο σίδηρο της αίμης (td = μs – ms) παρατηρούμε διφασική κινητική. Τα TRS2-FTIR φάσματα του συμπλόκου της M95A με το CO υποδηλώνουν μια ανταγωνιστικη διαδικασία επαναδέσμευσης μεταξύ του καταλοίπου Met95 και του CO. Τέλος, περιγράφεται η επίδραση των μεταλλάξεων R97A, R97I, F113T, N84V, Y126F, W53F και E93I στην κινητική επαναδέσμευσης του CO και στις ταυτόχρονες δυναμικές δομικές μεταβολές της πρωτείνης.

The discovery and characterization of new heme-based sensor proteins during the past decade has invigorated the interest in understanding the mechanism of heme-mediated recognition and discrimination of the diatomic gaseous ligands O2, NO and CO that act as signaling molecules for many biological processes. We have employed FTIR and time-resolved step-scan (TRS2) – FTIR spectroscopy to investigate the protein structural changes induced by ligand (CO) photodissociation and rebinding that are crucial for understanding the intramolecular signal transduction mechanism of three heme-based oxygen sensor proteins; HemAT-Bs, YddV and EcDOS. We have studied the full length and truncated sensor domain HemAT-CO adducts as well as the Y70F, L92A, T95A and Y133F mutants. We propose substantial structural reorientation for B- and G- helices upon CO binding. Moreover, the detection of secondary docking sites in the time-resolved step-scan FTIR experiments (td = 300 ns) of the wild type full length protein and the L92A mutant suggest that Leu92 operates as a conformational gate in the migration pathway of photodissociated CO. Time-resolved step-scan FTIR studies of wild type YddV and on the important in the oxygen recognition and stability of the heme Fe(II)-O2 distal L65T, L65M, Y43W, Y43F and Y43A mutants were performed to determine the site-specific protein dynamics following CO photodissociation. The TRS2-FTIR spectra show that the heme propionates are in the protonated and deprotonated state. Moreover, the rate of decay of the heme propionates and amide I vibrations are on a time-scale coincident with the rate of rebinding of CO suggesting that there is a coupling between ligation dynamics in the distal heme environment and a) the environment sensed by the heme propionates and b) the protein backbone relaxation. The TRS2- FTIR difference spectra of wild type EcDOSH upon CO photodissociation at td = 6 μs have demonstrated a 55% photoproduct yield, suggesting 45% CO geminate recombination. Monitoring the kinetic evolution of CO-rebinding on the microsecond-millisecond timescale has revealed biphasic kinetics. The TRS2-FTIR experiments on the CO adduct of the M95A mutant indicate a “binding and replacement” competitive rebinding process between Met95 and CO. The effect of the R97A, R97I, F113T, N84V, Y126F, W53F and E93I mutations on the kinetics of CO rebinding and concurrent protein conformational dynamics will be discussed.