Μελέτη των αντιδράσεων οξειδασών του κυτοχρώματος c με CN, N3 και NO2 με τη χρήση φασματοσκοπίας υπερύθρου και συντονισμού Raman

Abstract

Η κυτταρική αναπνοή είναι μια από τις σημαντικότερες λειτουργίες των ζώντων οργανισμών, καθώς οδηγεί στην παραγωγή ATP. H οξειδάση του κυτοχρώματος c αποτελεί το τελικό ένζυμο της αναπνευστικής αλυσίδας, καταλύοντας την αντίδραση αναγωγής του μοριακού οξυγόνου σε νερό και αντλώντας ταυτόχρονα πρωτόνια διαμέσου της μεμβράνης για τη δημιουργία ηλεκτροχημικού δυναμικού. Στην οικογένεια των αιμοχαλκοξειδασών ανήκουν οι οξειδάσες ba3 από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus (κατηγορία Β) και cbb3 από το βακτήριο Pseudomonas stutzeri (κατηγορία C). H παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη των αντιδράσεων εξωγενών υποκαταστατών (CN-, N3-, NO2-) με την ba3 οξειδάση και στη μελέτη της αντίδρασης της cbb3 οξειδάσης με το ΝΟ2- με τη χρήση φασματοσκοπίας απορρόφησης UV/Vis, FTIR και συντονισμού Raman. Στη μελέτη της αντίδρασης του CN- με την οξειδωμένη ba3 οξειδάση, τα πειράματα FTIR αποκάλυψαν τον αρχικό σχηματισμό γέφυρας μεταξύ του CN- και των δύο μετάλλων του ενεργού κέντρου (αίμη a3 Fe3+-C≡N-CuB2+) με χαρακτηριστική συχνότητα δόνησης v(CN) στους 2152 cm-1. Η αρχικά σχηματιζόμενη γέφυρα αντικαθίσταται από το σύμπλοκο αίμης a3 Fe2+-CN-, το οποίο χαρακτηρίστηκε από τη δόνηση v(CN) στους 2074 cm-1. Φωτοδιάσπαση του συμπλόκου αίμης a3 Fe2+-CN- οδήγησε στην εμφάνιση κορυφής στους 2146 cm-1, η οποία αποδόθηκε στο σχηματισμό του μεταβατικού συμπλόκου CuB2+-CN-. Περαιτέρω, αναλύθηκε η επίδραση του περιβάλλοντος του ενεργού κέντρου στα σχηματιζόμενα σύμπλοκα. Η μέλετη της αντίδρασης του Ν3- με την οξειδωμένη μορφή της ba3 οξειδάσης, φανέρωσε το σχηματισμό του συμπλόκου CuB2+-N3-, το οποίο χαρακτηρίζεται από την ασύμμετρη δόνηση v(N=Ν=Ν-)asym στους 2061 cm-1. Από τα πειράματα της ανταγωνιστικής δέσμευσης N3-/CN- επιβεβαιώθηκε ο σχηματισμός του συμπλόκου CuB2+-N3-, καθώς επίσης και η δέσμευση του Ν3- σε κατάλοιπα της πρωτεΐνης. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι οι οξειδάσες του κυτοχρώματος c των θηλαστικών διαθέτουν δραστικότητα αναγωγάσης του NO2- σε υποξικές και ανοξικές συνθήκες, ανάγωντας το ΝΟ2- σε ΝΟ. Στην προσπάθεια διερεύνησης του μηχανισμού δράσης των αιμοχαλκοξειδασών ως αναγωγάσες των νιτρωδών, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός της δομής του συμπλόκου της ba3 οξειδάσης με το ΝΟ2- με φασματοσκοπία συντονισμού Raman. Τα αποτελέσματα μας απέδειξαν το σχηματισμό ενός νίτρο-συμπλόκου της αίμης α3 στο ενεργό διμεταλλικό κέντρο αίμης/CuB με χαρακτηριστικές δονήσεις v(Fe-NO2-) και δ(ΟΝΟ) στους 568 και 786 cm-1, αντίστοιχα. Επιπλέον, αναλύθηκε ο ρόλος του εγγύς και του μακρινού περιβάλλοντος της αίμης a3 στη δομή και δραστικότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου. Η μελέτη της αντίδρασης της cbb3 οξειδάσης με το ΝΟ2- με φασματοσκοπία συντονισμού Raman και FTIR απέδειξε ότι το NO2- ανάγεται σε Ν2Ο μέσω του σχηματισμού του συμπλόκου αίμης b3 Fe2+-NO, που χαρακτηρίζεται από τις δονήσεις δ(Fe-N-O) και v(NO) στους 555 και 1592 cm-1, αντίστοιχα. Η cbb3 οξειδάση είναι το πρώτο μέλος της οικογένειας των αιμοχαλκοξειδασών που αναγνωρίστηκε ότι διαθέτει δραστικότητα αναγωγάσης των νιτρωδών και του μονοξειδίου του αζώτου.

Cytochrome c oxidase is the terminal enzyme in the respiratory chain. The enzyme catalyzes the reduction of molecular oxygen to water and uses the free energy that is produced to translocate protons across the inner mitochondrial (or bacterial) membrane generating the transmembrane electrochemical potential that is used by ATP synthase. The ba3 oxidase from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus (B-family) and cbb3 oxidase from Pseudomonas stutzeri (C-family) are members of the heme/copper oxidase superfamily. The research goal of the present PhD thesis was to investigate the reactions of ba3 oxidase from T. thermophilus with a variety of exogenous ligands (CN-, N3-, NO2-) and the reaction of cbb3 oxidase from P. stutzeri with NO2- by employing UV/Vis, FTIR and RR spectroscopies. In the reaction of oxidized ba3 oxidase with cyanide the FTIR experiments revealed that the initially formed heme a3 Fe3+-C≡N-CuB2+ species with ν(CN) frequency at 2152 cm-1 was replaced by a photolabile complex with a frequency at 2075 cm-1 characteristic of heme a3 Fe2+-CN-. Photolysis of the heme a3 Fe2+-CN- adduct produced a band at 2146 cm-1 attributed to the formation of a transient CuB2+-CN- complex. The role of the active site protein environment in the formation of the characterized species has been discussed. The study of the reaction of oxidized ba3 oxidase with N3- showed the formation of the CuB2+-N3- complex, characterized by the ν(N=N=N)asym at 2061 cm-1. A secondary protein binding site for N3- has been determined by the N3-/CN- ligand competition experiments. Recent studies indicate that the mitochondrial cytochrome c oxidase is able to catalyze the reduction of nitrite to nitric oxide in mammals. In an effort to investigate the nitrite reductase function of cytochrome c oxidases, we have investigated the reaction of ba3 oxidase with NO2-. The resonance Raman results revealed the formation of a ferrous heme a3-nitro complex in the binuclear heme a3/CuB center that is characterized by the Fe-NO2 stretching vibration at 568 cm-1 and bending NO2 mode at 786 cm-1. The distinct roles of the distal and proximal heme protein environments in determining the structure of the heme-bound nitrite species are outlined. We have investigated the reaction of nitrite with the C-family cbb3 oxidase from P. stutzeri under reducing anaerobic conditions by employing resonance Raman and FTIR spectroscopy. We provide experimental evidence that cbb3 oxidase catalyzes the reduction of NO2- to N2O through the formation of a six-coordinate ferrous heme b3 Fe2+-NO adduct characterized by the δ(Fe-N-O) and ν(NO) at 555 and 1592 cm-1, respectively. The cbb3 oxidase is the first member of the heme/copper oxidase family identified as capable of functioning both as nitrite and nitric oxide reductase.