Προσδιορισμός της συνολικής πολυφαινολικής περιεκτικότητας και αντιοξειδωτικής ικανότητας εκχυλισμάτων σάρκας χαρουπιού με τη χρήση φασματοσκοπίας FTIR και χημειομετρίας

Abstract

Τρόφιμα φυτικής προέλευσης και αντιοξειδωτικά συστατικά που προσλαμβάνονται μέσω της διατροφής, όπως είναι για παράδειγμα οι φυτοχημικές ουσίες της κατηγορίας των πολυφαινολών, συγκεντρώνουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον εξαιτίας της προληπτικής τους δράσης κατά της οξειδωτικής βλάβης των κυτταρικών συστατικών. Η σάρκα χαρουπιού αποτελεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα με σημαντική περιεκτικότητα σε πολυφαινολικά συστατικά. Η σύσταση, η πολυφαινολική περιεκτικότητα και η αντιοξειδωτική της συμπεριφορά επηρεάζονται από πολλούς και διαφορετικούς παράγοντες. Αρκετές αναλυτικές μέθοδοι έχουν προταθεί και εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό των αντιοξειδωτικών παραμέτρων δειγμάτων χαρουπιού. Ωστόσο, προϋποθέτουν χρονοβόρες εργαστηριακές διαδικασίες, κατανάλωση τοξικών αντιδραστηρίων και ειδικό εξοπλισμό. Ως εναλλακτική προσέγγιση προτείνεται η αξιοποίηση της φασματοσκοπίας FTIR, η οποία παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τη σύσταση του δείγματος σε μικρό χρόνο ανάλυσης και έχει μηδαμινό αντίκτυπο στο περιβάλλον. Στόχος της παρούσας ερευνητικής μελέτης ήταν η αξιοποίηση της φασματοσκοπίας FTIR για την πρόβλεψη της συνολικής πολυφαινολικής περιεκτικότητας (Total Polyphenolic Content, TPC) και της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (Total Antioxidant Capacity, TAC) εκχυλισμάτων σάρκας χαρουπιού. Για τον σκοπό αυτό, προσδιορίστηκαν η TPC και η TAC 51 δειγμάτων, αξιοποιώντας συμβατικές μεθόδους ανάλυσης και βάσει αυτών κατασκευάστηκαν μοντέλα παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial Least Squares Regression, PLSR) κατόπιν συσχέτισης των τιμών αναφοράς και των φασματοσκοπικών δεδομένων FTIR (4000–400 cm-1) των εκχυλισμάτων. Η TPC (42,9–202,2 mg ισοδύναμων γαλλικού οξέος/g εκχυλίσματος) και η συγκέντρωση γαλλικού οξέος (1,3–4,1 mg γαλλικού οξέος/g εκχυλίσματος) προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu και την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων, αντίστοιχα. Η TAC προσδιορίστηκε με τη μέθοδο απόσβεσης της ελεύθερης ρίζας 2,2,-διφαινυλο-1-πικρυλυδραζυλίου (DPPH) και εκφράστηκε μέσω των τιμών EC50 (10,0–100,3 μg/mL εκχυλίσματος), ενώ προσδιορίστηκε επίσης μέσω της δοκιμής FRAP (76,9–379,3 mg ισοδύναμων Trolox/g εκχυλίσματος). Τα μοντέλα PLSR αξιολογήθηκαν με την τεχνική διασταυρούμενης επικύρωσης (Cross-Validation). Στα πλαίσια εξωτερικής επικύρωσης αξιοποιήθηκαν φασματοσκοπικά δεδομένα FTIR επιπλέον δειγμάτων τα οποία είχαν αντιμετωπιστεί ως άγνωστα. Η προγνωστική ικανότητα του μοντέλου που αξιοποίησε σαν τιμές αναφοράς αυτές της μεθόδου Folin-Ciocalteu (r2CAL>0,97, r2PRED>0,86) χαρακτηρίστηκε ως πολύ καλή, με χαμηλές τιμές για τα σφάλματα πρόβλεψης, RMSEC και RMSEP, ενώ για τα μοντέλα που προχώρησαν σε πρόβλεψη της TAC μέσω των δοκιμών DPPH (r2CAL>0,88, r2PRED>0,76) και FRAP (r2CAL>0,74, r2PRED>0,83) κρίθηκε ικανοποιητική. Το μοντέλο που επιχείρησε τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης γαλλικού οξέος (r2CAL>0,36, r2PRED>0,02) δεν έδειξε επιτυχία πρόβλεψης. Στα πλαίσια βελτιστοποίησης των μοντέλων PLSR εξετάστηκαν επιμέρους περιοχές του φάσματος. Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν ανέδειξαν τις περιοχές 3585–2810 και 1711–912 cm-1 σημαντικές για την πρόβλεψη της αντιοξειδωτικής ικανότητας των πολυφαινολικών εκχυλισμάτων. Επιπλέον, εξετάστηκε η επιρροή που έχει στην προγνωστική ικανότητα των μοντέλων η μέθοδος προεπεξεργασίας των φασμάτων FTIR, συγκρίνοντας αποτελέσματα που λήφθηκαν από την αξιοποίηση κανονικοποιημένων ή παραγωγοποιημένων φασμάτων που προέκυψαν από τον υπολογισμό της πρώτης και της δεύτερης παραγώγου. Συνοπτικά, η φασματοσκοπία FTIR σε συνδυασμό με τη χημειομετρική ανάλυση αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για μελλοντικές έρευνες σε δείγματα σάρκας χαρουπιού. Η προτεινόμενη μέθοδος μπορεί να αξιοποιηθεί τόσο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της TPC, όσο και για την εκτίμηση της TAC, όπως αυτή μπορεί να προσδιοριστεί μέσω των δοκιμών DPPH και FRAP, πολυφαινολικών εκχυλισμάτων σάρκας χαρουπιού.

Natural foοds and food-related antioxidants, such as phenolic phytochemicals, are of great interest due to their preventive properties against oxidative damage. Carob pulp contains high quality and amount of phenolic compounds. The composition of carob pulp, its phenolics and antioxidant power are influenced by numerous factors causing great variation among samples. Several wet chemistry techniques have been repοrted for measuring these antioxidant parameters of the fruit. However, conventional analytical methods entail long and complicated laboratory procedures, the use of toxic chemicals and specific instrumentation. One appealing alternative is the use οf Fourier-Transform Infrared (FTIR) spectroscopy since it provides information about the sample composition quickly and it is multi-parametric and envirοnmentally friendly choice. The aim of this study was to use FTIR spectroscopy for the prediction of the total polyphenolic content (TPC) and total antioxidant capacity (TAC) of carob pulp extracts. Therefore, the TPC and TAC of 51 samples were investigated using conventional reference methods and FTIR-based (4000–400 cm-1) partial least squares regression (PLSR) models were developed to predict these parameters. Phenolic contents, including total phenol and gallic acid monomer, were first quantified using Folin-Ciocalteu assay (42.9–202.2 mg gallic acid equivalents/g dry weight of extract) and reversed-phase high performance liquid chromatography coupled with diode array detector (RP-HPLC-DAD) (1.3–4.1 mg gallic acid/g dry weight of extract), respectively. Antioxidant capacities were characterised using DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) assay and the results were expressed as EC50 values (10.0–100.3 μg/mL of extract) and FRAP assay (76.9–379.3 mg Trolox equivalents/g dry weight of extract). PLSR models were constructed and cross-validated using FTIR spectra of phenolic-rich extracts and corresponding reference values determined using Folin-Ciocalteu, DPPH, FRAP and HPLC assays. Spectra from additional extracts were used as an external validation set for the models. PLSR models showed very good prediction capability for Folin-Ciocalteu (r2CAL>0.97, r2PRED>0.86), accompanied with low errors of prediction, RMSEC and RMSEP, good prediction capability for DPPH (r2CAL>0.88, r2PRED>0.76) and FRAP (r2CAL>0.74, r2PRED>0.83), but lacked accuracy in the prediction of the concentration of the gallic acid monomer (r2CAL>0.36, r2PRED>0.02). In an attempt to increase the performance of the PLSR calibration models, subregions of the whole mid-infrared (MIR) spectra were examined. The developed PLSR models revealed that the spectral regions of 3585–2810 and 1711–912 cm-1 are important for antioxidant activity prediction of the analysed phenolic-rich extracts. The effects of FTIR spectra preprocessing methods (normalization, first and second derivative) transformations on the performance of PLSR models were also evaluated. Overall, FTIR spectroscopy along with chemometrics exhibited great potential for future carob pulp studies. The proposed method may be used for rapid screening of TPC and to get estimates for DPPH and FRAP antioxidant capacities of phenolic-rich extracts.