Ορθολογικός σχεδιασμός πολυστρωματικών γαλακτωμάτων για την προστασία ευαίσθητων στην οξείδωση συστατικών τροφίμων

Abstract

Αντικείμενο μελέτης της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής αποτελεί ο ορθολογικός σχεδιασμός πολυστρωματικών γαλακτωμάτων ελαίου σε νερό (ο/w) για την ενθυλάκωση ελαίου που περιέχει τα βιοδραστικά ωμέγα-3 λιπαρά οξέα εικοσιδυοεξαενοϊκό οξύ (DHA) και εικοσιπενταενοϊκό οξύ (EPA), με σκοπό τη μακροπρόθεσμη σταθερότητά τους. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα είναι να διασφαλιστεί ότι τα αντιοξειδωτικά θα βρίσκονται στις διεπιφάνειες των σταγονιδίων μέσω σύνδεσής τους με τους γαλακτωματοποιητές ή τους πολυηλεκτρολύτες των πολυστρωμάτων με μη-ομοιοπολικές συζεύξεις. Με τον τρόπο αυτό επιδιώκεται να αυξηθεί η οξειδωτική σταθερότητα της λιπιδικής φάσης. Στην παρούσα εργασία επιχειρείται η ενίσχυση της διεπιφανειακής εναπόθεσης των αντιοξειδωτικών μορίων στα πολυστρωματικά γαλακτώματα (ΠΓ) χρησιμοποιώντας μια «ορθολογική» διαδοχική προσέγγιση, βασισμένη στις αρχές της χημείας κολλοειδών και επιφανειών. Σε αυτήν την κολλοειδή προσέγγιση τριών βημάτων, αρχικά σχηματίζονται τα «βέλτιστα» συμπλέγματα μεταξύ αντιοξειδωτικού και πρωτεΐνης ή πολυσακχαρίτη σε διάλυμα, στη συνέχεια τα συμπλέγματα αυτά μεταφέρονται σε στερεό υπόστρωμα σε κατάλληλη πολυστρωματική εναπόθεση και τέλος οι βέλτιστοι πολυστρωματικοί συνδυασμοί προάγονται για τη σταθεροποίηση σταγονιδίων στα ΠΓ. Οι αλληλεπιδράσεις αντιοξειδωτικών – βιοπολυμερών σε υδατικά διαλύματα μετρούνται χρησιμοποιώντας φασματοσκοπικές και θερμοδυναμικές μεθόδους, όπως η φασματοσκοπία φθορισμού, η φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού και η θερμιδομετρία ισοθερμικής τιτλοδότησης. Σε ένα δεύτερο στάδιο, αποδεικνύεται ότι τα συμπλέγματα αντιοξειδωτικών – βιοπολυμερών μπορούν να σχηματίσουν υψηλής ποιότητας δομές στρώματος προς στρώμα (layer-by-layer, LbL) με τα υπόλοιπα επιλεγμένα βιοπολυμερή σε επίπεδες στερεές επιφάνειες. Ο επιτυχής σχηματισμός πολυστρωματικών δομών παρακολουθείται με φασματοσκοπία UV-Vis, με τη χρήση μικροζυγού κρυστάλλου χαλαζία (QCM) και με φασματοσκοπία ανάκλασης απορρόφησης υπερύθρου (PM-IRRAS). Η εργασία LbL χρησιμεύει στην επιλογή των καλύτερων συνδυασμών βιοπολυμερών στα πολυστρώματα, περιορίζοντας τον μεγάλο αριθμό πιθανών επιλογών σε εκείνα τα συστήματα που επιδεικνύουν την καλύτερη συνέργεια σε μια στερεή επιφάνεια. Στο τρίτο στάδιο, σχηματίζονται ΠΓ με τα επιλεγμένα συστατικά σε συνδυασμό με το αντιοξειδωτικό σε διάφορα πιθανά στρώματα. Η αντιοξειδωτική προστασία που παρέχεται έτσι στα ευαίσθητα έλαια για διάφορες δυνατές διεπιφανειακές γεωμετρίες μπορεί να εξετασθεί με διάφορες μεθόδους. Για τον έλεγχο της οξειδωτικής σταθερότητας της λιπιδικής φάσης των ΠΓ επιλέχθηκε μια έμμεση μέθοδος, όπου αξιολογείται η ροή ελευθέρων ριζών από τη συνεχή φάση προς την ελαιώδη φάση. Ως αντιοξειδωτικά επιλέχθηκαν το ταννικό οξύ, που χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο, και οι βηταλαΐνες μια ομάδα φυσικών αντιοξειδωτικών που απομονώνονται από τα κόκκινα τεύτλα. Ως πρωτοταγείς γαλακτωματοποιητές επιλέχθηκε το πρωτεϊνικό υπερσυμπύκνωμα του όρου του γάλακτος (Whey protein isolate – WPI) και η αλβουμίνη του βόειου ορού (ΒSA - Bovine Serum Albumin). Η χιτοζάνη χρησιμοποιείται ως κατιοντικό στρώμα στα ΠΓ, ενώ η θειική χονδρoΐτίνη, το αλγινικό νάτριο, το καζεϊνικό νάτριο και η πηκτίνη ως ανιοντικά στρώματα, ανάλογα με την τιμή του pH. Από τις μελέτες σε διάλυμα προέκυψε και για τα δύο αντιοξειδωτικά πως αλληλεπιδρούν ισχυρότερα με την πρωτεΐνη ΒSA. Στο δεύτερο βήμα, χρησιμοποιείται εναπόθεση στρώμα προς στρώμα (LbL) σε στερεές επιφάνειες για να προσδιοριστεί ποιοι από τους πολυσακχαρίτες σε συνδυασμό με BSA / ταννικό οξύ ή BSA / βηταλαΐνες σε ένα σύστημα πολλών στρωμάτων διασφαλίζουν τη μέγιστη παρουσία του αντιοξειδωτικού στις διεπιφάνειες. Από τις φασματοσκοπικές μεθόδους απορρόφησης (PM-IRRAS και UV-Vis) προκύπτει ότι τα αποτελεσματικότερα συστατικά που πρέπει να χρησιμοποιούνται σε πολυστρωματικά γαλακτώματα μαζί με BSA / ταννικό οξύ είναι η χιτοζάνη και η πηκτίνη. Στη συνέχεια η BSA, η χιτοζάνη και η πηκτίνη χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό γαλακτωμάτων ο/w τριών στρωμάτων με το ταννικό οξύ ή τις βηταλαΐνες να εισάγονται σε οποιαδήποτε από τις τρεις στιβάδες ως αντιοξειδωτικά. Εκτιμήθηκε η επίδραση της ακριβούς τοποθέτησης των αντιοξειδωτικών στην οξειδωτική σταθεροποίηση του λινελαίου με παρακολούθηση του φθορισμού της χρωστικής Nile Red, η οποία είναι διαλυμένη στα σταγονίδια ελαίου, υπό την προσβολή από ελεύθερες ρίζες που δημιουργούνται στην υδατική φάση του γαλακτώματος. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η διαδικασία τριών σταδίων που παρουσιάζεται εδώ μπορεί υπό προϋποθέσεις να οδηγήσει σε ενισχυμένο εντοπισμό των αντιοξειδωτικών στις διεπιφάνειες των ΠΓ, αρκεί αυτά να έχουν επιφανειοενεργό χαρακτήρα ή να αναπτύσσουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις με τους γαλακτωματοποιητές, ώστε να αποκτούν τέτοιο χαρακτήρα. Από την άποψη αυτή το ταννικό οξύ είναι ιδανικό αντιοξειδωτικό, αλλά οι βηταλαΐνες όχι. Οι τελευταίες θα πρέπει να μελετηθούν περαιτέρω για την καλύτερη αξιοποίησή τους σε ΠΓ.

Subject of this Doctoral Thesis is the systematic design of multilayer oil in water (o/w) emulsions for the encapsulation of oil that contains the bioactive omega-3 fatty acids docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA), in order to retain their long-term stability towards oxidation. A major difficulty is to ensure the maximal presence of the antioxidants at the droplet interfaces via non-polar coupling with the emulsifiers or the polyelectrolyte multilayers. In this way, it is sought to increase the oxidative stability of the lipid phase. The present work aims towards the enhancement of the interfacial deposition of the antioxidant molecules in the multilayer emulsions (MEs), utilizing a systematic approach, based on the fundamentals of colloidal and surface chemistry. In the adopted three step colloidal based approach, the "optimal" complexes between an antioxidant and a protein or polysaccharide are first formed in a solution, followed by the transfer of these complexes to a solid substrate in a suitable multilayer deposition. Finally the optimal multilayer combinations are used for the droplet stabilization on the MEs. First, antioxidant-biopolymer interactions in aqueous solutions are measured using spectroscopic and thermodynamic methods, such as fluorescence spectroscopy, circular dichroism spectroscopy and isothermal titration calorimetry. In a second step, it is demonstrated that the optimal antioxidant-biopolymer complexes can form high quality layer-by-layer structures (LbL) with the remaining selected biopolymers on flat solid surfaces. The successful formation of multilayer structures is monitored by UV-Vis spectroscopy, quartz crystal microbalance (QCM) measurements and infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS). The LbL work serves to select the best biopolymer combinations in multilayers by limiting the large number of possible options to those systems that exhibit the best synergy at a solid surface. Thirdly, MEs are formed with the selected ingredients in combination with the antioxidant in several possible layers. The antioxidant protection provided to sensitive oils by the various possible interfacial geometries can be examined by a variety of methods. An indirect method was chosen here to assess the oxidative stability of the lipid phase of the MEs, by measuring the flow of free radicals from the continuous phase towards the oil phase. Tannic acid, which was used as a standard, and betalains, a group of natural antioxidants isolated from red beet roots, were selected as the antioxidants. Whey protein isolate (WPI) and bovine serum albumin (BSA) were used as the primary emulsifiers. Chitosan is used as the cationic layer, while chondroitin sulfate, sodium alginate, sodium caseinate and pectin are used as the anionic layers, depending on the pH value. The studies in solution have shown that both chosen antioxidants interact more strongly with BSA. As a second step, LbL deposition on solid surfaces was used to determine which polysaccharides in combination with BSA / Tannic Acid and BSA / Betalains in a multilayer system ensure the maximum transfer of the antioxidant at the interfaces. From the spectroscopic absorption methods (PM-IRRAS and UV-vis) it is suggested that the best ingredients to use in a multilayer emulsion droplet, along with BSA / tannic acid, are chitosan and pectin. BSA, chitosan and pectin are then used to form three-layer o/w emulsions and tannic acid or betalains are introduced into either one of the three layers as antioxidants. The effect of the precise placement of the antioxidants on the oxidative stabilization of linseed oil under attack from radicals produced in the aqueous phase of the emulsion was evaluated by monitoring the fluorescence of the dye Nile Red, which is dissolved in the oil droplets. The results show that the three-step process presented here can, under certain conditions, serve to increase the localization of antioxidants on the interfaces of the MEs, as long as they are surface active or develop strong interactions with emulsifiers to acquire such character. In this respect, tannic acid is an ideal antioxidant, but betalains are not. The latter should be further studied for better utilization in ME work.