Fate of antibiotic resistance determinants during conventional and advanced wastewater treatment and in the wastewater-soil-plant continuum during irrigation with reclaimed water

Abstract

Η διδακτορική αυτή διατριβή είχε ως στόχο τη δημιουργία νέας γνώσης αναφορικά με τη διάδοση ρύπων αναδυόμενου ενδιαφέροντος (CECs) και μικροβιολογικών παραγόντων που αφορούν την ανθεκτικότητα στην αντιβίωση (AMR) στο περιβάλλον μέσω των υφιστάμενων πρακτικών απόρριψης και επαναχρησιμοποίησης των επεξεργασμένων αστικών λυμάτων. Οι κύριοι τομείς της έρευνας περιλαμβάνουν: i) την αξιολόγηση της απόδοσης υφιστάμενων τεχνολογιών δευτεροβάθμιας βιολογικής επεξεργασίας (ενεργού ιλύος (CAS) και βιοαντιδραστήρα μεμβρανών (MBR)) για την απομάκρυνση χημικών CECs και επιλεγμένων μικροβιολογικών παραγόντων, ii) τη διερεύνηση πρόσληψης των ρύπων αυτών από φυτά καθώς και τη συγκράτησή τους από το έδαφος σε καλλιέργειες που αρδεύονται με επεξεργασμένα λύματα σε πραγματικές συνθήκες, iii) την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της διεργασίας του οζονισμού με χρήση αντιδραστήρα διαλείποντος έργου και αντιδραστήρα συνεχούς ροής για την απομάκρυνση των CECs και επιλεγμένων μικροβιολογικών παραγόντων που υπάρχουν στα επεξεργασμένα με CAS ή MBR λύματα καθώς και της ενδεχόμενης τοξικότητας που δημιουργείται στις επεξεργασμένες ροές μετά τον οζονισμό (φυτο- και οικο-τοξικότητα), και iv) τη διενέργεια τεχνοοικονομικής αξιολόγησης της επεξεργασίας με όζον λαμβάνοντας υπόψη τα πειραματικά αποτελέσματα που λήφθηκαν για την απομάκρυνση των επιλεγμένων χημικών ρύπων και μικροβιολογικών παραγόντων. Στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής εξετάστηκε η παρουσία επιλεγμένων φαρμακευτικών ουσιών, βακτηρίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά και γονιδίων που φέρουν ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά στις ροές εισόδου και εξόδου των σταθμών επεξεργασίας αστικών λυμάτων. Διερευνήθηκε η παρουσία επιλεγμένων φαρμακευτικών ουσιών και η πιθανή αλλαγή της δομής της βακτηριακής κοινότητας μέσω αλληλουχίας 16S rRNA στα επεξεργασμένα λύματα, έδαφος, φυτά και αποστραγγίσματα που προέκυψαν από τις πειραματικές καλλιέργειες με άρδευση με επεξεργασμένα λύματα σε πραγματικές συνθήκες. Για την αξιολόγηση του οζονισμού οι εξεταζόμενες παράμετροι περιλάμβαναν (α) την απομάκρυνση επιλεγμένων αντιβιοτικών ενώσεων, (β) την αναστολή λειτουργίας αλλά και επαναδραστηριοποίησης (regrowth) ολικών και ανθεκτικών σε επιλεγμένες αντιβιοτικές ενώσεις βακτηρίων (faecal coliforms, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp. και total heterotrophs), (γ) την απομάκρυνση επιλεγμένων γονιδίων που φέρουν ανθεκτικότητα στις αντιβιοτικές ενώσεις (sul1, qacΔΕ1, aadA1 και dfrA1), (δ) τη μείωση του οργανικού φορτίου του αποβλήτου, και (στ) την τοξικότητα του αποβλήτου μετά τον οζονισμό έναντι επιλεγμένων φυτικών ειδών και οργανισμών. Η έρευνα στις ροές εισόδου και εξόδου σε σταθμούς επεξεργασίας αστικών λυμάτων που εφαρμόζουν τεχνολογίες επεξεργασίας CAS και MBR έδειξε την ανεπάρκεια τους να αντιμετωπίσουν πλήρως τις επιλεγμένες ρυπαντικές παραμέτρους. Κατά συνέπεια η απόρριψη επεξεργασμένων λυμάτων σε περιβαλλοντικούς αποδέκτες ή η επαναχρησιμοποίησή τους για σκοπούς άρδευσης πρέπει να εξεταστεί περαιτέρω σε σχέση με τους κινδύνους για το περιβάλλον και τη γεωργική παραγωγή. Οι πειραματικές καλλιέργειες μαρουλιού που αναπτύχθηκαν σε λυσίμετρα κάτω από πραγματικές συνθήκες καλλιέργειας και με άρδευση με επεξεργασμένα λύματα από CAS ή MBR, έδειξαν ότι λαμβάνει χώρα συσσώρευση CECs στο έδαφος και στα αποστραγγίσματα καθώς και ότι λαμβάνει χώρα πρόσληψη από τα φυτά. Διαφάνηκε ότι διάφοροι βιοτικοί και αβιοτικοί παράγοντες επηρεάζουν την πιθανή πρόσληψη και συσσώρευση αυτών των CECs στο περιβάλλον. Δεν υπήρξε αξιοσημείωτη μεταβολή στη δομή της μικροβιακής κοινότητας των δειγμάτων εδάφους και μαρουλιών που αρδεύτηκαν με επεξεργασμένα λύματα. Η ανάλυση των προϊόντων της πολυμερικής αλυσιδωτής αντίδρασης του γονιδίου 16S rRNA έδειξε ότι η αποθήκευση του επεξεργασμένου λύματος επηρεάζει τη δομή της μικροβιακής κοινότητας. Οι διακυμάνσεις των αλληλουχιών στην εδαφική μικροβιακή κοινότητα φαίνεται να επηρεάζονται από την άρδευση με επεξεργασμένα λύματα, ειδικότερα στο ανώτερο στρώμα εδάφους. Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με την αύξηση του εδαφικού βάθους υπάρχει μικρότερη διαφοροποίηση της μικροβιακής κοινότητας. Η ανάλυση σε σχέση με την αφθονία των παθογόνων βακτηρίων δεν έδειξε κάποια σαφή ένδειξη πολλαπλασιασμού ή συσσώρευσης αυτών των βακτηρίων στα δείγματα εδάφους που αρδεύονται με επεξεργασμένα λύματα και των αποστραγγισμάτων τους. Η διεργασία του οζονισμού σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου πέτυχε πλήρη απομάκρυνση των αντιβιοτικών ενώσεων και αδρανοποίησε αποτελεσματικά τα εξεταζόμενα ολικά και ανθεκτικά στις αντιβιοτικές ενώσεις βακτήρια, ενώ δεν παρατηρήθηκε βακτηριακή επαναδραστηριοποίηση μετά από 72 ώρες αποθήκευσης. Το μοντέλο Chick-Watson που εφαρμόστηκε και προέβλεψε τις απαιτήσεις έκθεσης στο όζον CT (γινόμενο συγκέντρωσης όζοντος επί το χρόνο παραμονής), έδειξε ότι τα διαφορετικά ποιοτικά χαρακτηριστικά της μήτρας των λυμάτων ενδέχεται να επηρεάζουν την απαίτηση CT για την αδρανοποίηση της εξεταζόμενης μικροβιακής ομάδας. Η αφθονία των γονιδίων μειώθηκε με τον οζονισμό, όμως παρατηρήθηκε αύξηση στην αφθονία τους 72 ώρες μετά την αποθήκευση των δειγμάτων. Η πολύ χαμηλή απομάκρυνση του οργανικού φορτίου με τον οζονισμό δυνατόν να εξηγεί την ευρεθείσα αύξηση της φυτο- και της οικο-τοξικότητας. Η διαδικασία οζονισμού σε αντιδραστήρα συνεχούς ροής, έδειξε ότι οι χαμηλές δόσεις όζοντος συνοδευόμενες από παρατεταμένο χρόνο επαφής είναι ικανές να απομακρύνουν αντιβιοτικές ενώσεις. Και στην περίπτωση αυτή δεν παρατηρήθηκε σημαντική απομάκρυνση του οργανικού φορτίου. Οι υψηλοί χρόνοι παραμονής και οι χαμηλές δόσεις όζοντος επιτυγχάνουν την απενεργοποίηση του E. coli, καθώς και τη μείωση της αφθονίας των εξεταζόμενων γονιδίων. Ωστόσο, η αύξηση στην αφθονία των εξεταζόμενων γονιδίων και πιο συγκεκριμένα του 16S rRNA μετά από 72 ώρες, υποδεικνύει ότι φαινόμενα επαναδραστηριοποίησης δεν μπόρεσαν να ανασταλούν με τον οζονισμό καθώς βιώσιμα κύτταρα συνέχισαν να υπάρχουν στα επεξεργασμένα δείγματα πέραν αυτών που εξετάστηκαν και διαπιστώθηκε ότι είχαν απενεργοποιηθεί μετά από την παρατεταμένη επεξεργασία. Συμπερασματικά, η διεργασία του οζονισμού μπορεί να αποτελέσει μια ικανοποιητική επιλογή τριτοβάθμιας επεξεργασίας σε σχέση με την απομάκρυνση των CECs και μικροβιολογικών παραγόντων. Η τεχνοοικονομική αξιολόγηση του οζονισμού έδειξε ότι το χαμηλό πάγιο και λειτουργικό κόστος καθιστούν τη διεργασία κατάλληλη για τριτοβάθμια επεξεργασία των επεξεργασμένων λυμάτων. Ωστόσο, μετά τον οζονισμό απαιτείται περαιτέρω επεξεργασία ώστε να ξεπερνούνται οι κύριοι περιορισμοί αυτής της διαδικασίας σε σχέση με την τοξικότητα και τα φαινόμενα επαναδραστηριοποίησης των μικροβιολογικών παραγόντων, ελαχιστοποιώντας έτσι τους πιθανούς κινδύνους που υπάρχουν σε σχέση με τους περιβαλλοντικούς αποδέκτες και οικοσυστήματα.

This doctoral dissertation aims at shedding light into currently open questions providing insight and in-depth investigation into the issue of spreading and proliferation of contaminants of emerging concern (CECs) and antimicrobial resistance (AMR) in natural environmental compartments through the disposal and reuse of reclaimed water. The main goals of this study were to i) assess the performance of full-scale secondary biological treatment technologies (i.e., conventional activated sludge (CAS) and membrane bioreactor (MBR)) regarding the removal of chemical CECs and microbiological contaminants, ii) investigate the potential uptake and proliferation of these contaminants into crops irrigated with reclaimed water (RW) in real-field conditions, iii) evaluate the efficiency of ozonation operated in batch and continuous mode, in simultaneously removing the chemical CECs and microbiological contaminants from CAS or MBR treated wastewater and evaluating also the toxicity (i.e., phytotoxicity and ecotoxicity) after ozonation, and iv) perform a comprehensive techno-economic evaluation of the continuous-mode ozonation process based on the achieved removal efficiencies of the examined contaminants. In the framework of the doctoral dissertation, the fate of selected chemical CECs and microbiological contaminants was investigated in the inflow and outflow streams intended to be reused for irrigation, of actual treatment plants. The investigation of the occurrence of selected pharmaceuticals and the potential shifts of the bacterial community structure through 16S rRNA sequencing took place in different environmental matrices (i.e., reclaimed water, soil, crop, and leachate) resulting from the cultivation experiments under real-field conditions. To evaluate the ozonation process the following parameters were examined: (a) the removal of selected antibiotics, (b) the inactivation and the regrowth of bacteria (i.e., Feacal coliforms, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp. and total heterotrophs) and their antibiotic-resistant counterpart to the selected antibiotics, (c) the removal of selected genes (i.e.,16S rRNA and intl1) and antibiotic resistance genes (e.g., sul1, qacΔΕ1, aadA1 and dfrA1), (d) the removal of dissolved effluent organic matter (dEfOM) expressed as Dissolved Organic Carbon (DOC), and (e) the evolution of eco- and phyto-toxicity against selected plant species and organisms. The investigation of the inflow and outflow of the actual treatment plants applying CAS and MBR treatment technologies revealed their inadequacy to entirely remove and inactivate the examined chemical CECs and microbiological contaminants. Therefore, it was imperative that the discharge of reclaimed water in environmental receptors or its reuse for irrigation was further examined with respect to the risk for the receiving environments, the associated food produce and consequently to human health. The crop (i.e., lettuce) cultivation experiments in lysimeters under real-field conditions, irrigated with reclaimed water after CAS and MBR treatment, revealed that the occurrence, accumulation (i.e., soil and leachate), and uptake (i.e., crop) of the examined chemical CECs was indeed taking place. Several biotic and abiotic factors have been proven to influence the potential uptake and accumulation of these CECs. The 16S rRNA amplicon sequencing analysis revealed that the storage of the reclaimed water influenced the structure of the microbial community. In terms of amplicon sequence variants, especially the top soil microbial community, seemed to be influenced by the reclaimed water irrigation. The results also revealed that with increasing soil depth, a lower influence on microbial community of irrigation regime exists. The differentially abundant putative pathogen analysis did not provide any clear indication on the potential bacterial proliferation and accumulation in the different environmental compartments irrigated with reclaimed water. The ozonation process operating in batch mode achieved a complete removal of the examined antibiotic compounds and efficiently inactivated the examined total and antibiotic-resistant bacteria, while no bacterial regrowth was observed after 72 h of storage. The Chick-Watson model-predicted ozone exposure CT (product of ozone concentration and exposure time) requirements, showed that the different quality characteristics of the wastewater matrix might influence the CT requirement for the inactivation of the examined microbial group. The genes abundance decreased significantly by the process, but an increase in their abundance was observed 72 h after storage of the treated samples. Low removal of DOC was achieved by ozonation and at the same time phyto- and eco-toxicity increased. The continuous-mode ozonation showed that low ozone doses, accompanied by prolonged treatment time, was required to eliminate the examined antibiotic compounds. No substantial mineralization was observed, a fact that may explain the enhanced phytotoxicity of the ozonated samples. Ozonation operated at higher HRT and ozone doses was capable of inactivating E. coli, as well as reducing the abundance of the examined genes, including ARGs. However, regrowth phenomena could not be eliminated during ozonation since after 72 hours, living cells were found to exist in the treated samples, even after prolonged treatment. The increase in the abundance of the examined genes, and more specifically of 16S rRNA, in the ozone-treated samples after 72 h of storage, indicated the existence and replication of other types of non-investigated bacteria. In conclusion, it was shown that ozonation upon its proper optimisation constitutes an efficient treatment option for the removal of antibiotic-related microcontaminants from reclaimed water. The performance of the techno-economic evaluation of ozonation process showed that the low capital and operational cost of the ozonation process made it a well-fit process for tertiary treatment in a full-scale treatment plant. However, ozonation needs to be followed by a post-treatment such as activated carbon adsorption to overcome one of the main limitations of this process in relation to toxicity. The potential bacterial regrowth should also not be neglected, and further investigation should be performed to better understand this aspect. This knowledge is important and would provide valuable information on the capacity of the treatment to address water contamination challenges that may have environmental implications for the application of ozone.