Γενετική ετερογένεια και μοριακή εξέλιξη του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1)

Abstract

Στην παρούσα ερευνητική διατριβή μελετήθηκε η μοριακή ετερογένεια του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1), με επίκεντρο τις επιδράσεις της μοριακής εξέλιξης του ιού ως προς την φυσική του ετερογένεια και την επιλεκτική πίεση από τα αντιρετροϊκά φάρμακα. Για την επίτευξη του πιο πάνω στόχου, διεξήχθησαν τρεις επιμέρους μελέτες, στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από HIV-1 οροθετικούς ασθενείς που διαγνώσθηκαν στην Κύπρο από το 1986 έως το 2006. Η μοριακή επιδημιολογία της HIV-1 μόλυνσης μελετήθηκε για πρώτη φορά στην Κύπρο στα μέσα της δεκαετίας του '90, αλλά η έκταση της HIV-1 γενετικής ποικιλομορφίας παρέμεινε απροσδιόριστη τα τελευταία 20 χρόνια. Σε μια προσπάθεια να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα έγινε μια αναδρομική μελέτη για να διερευνηθεί η γενετική διασπορά του ιού HIV-1 και να καθοριστεί η δυναμική της επιδημίας στην Κύπρο. Εξετάστηκαν στελέχη από μια ομάδα 77 HIV-1 οροθετικών που αντιπροσωπεύουν το 38% του γνωστού μολυσμένου πληθυσμού στην Κύπρο την περίοδο 1986 έως 2006. Το RNA του σχεδόν-πλήρες μήκους γονιδιώματος πολλαπλασιάστηκε σε τέσσερα διαδοχικά nested RT-PCRs σε όλα τα HIV-1 δείγματα και αλληλουχήθηκε, χρησιμοποιώντας ένα νέο πρωτόκολλο. Έγιναν λεπτομερείς φυλογενετικές αναλύσεις και αναλύσεις ανασυνδυασμού στις αλληλουχίες των δειγμάτων για τη φυλογενετική ταξινόμηση των στελεχών. Τα αποτελέσματα της φυλογενετικής ανάλυσης των HIV-1 αλληλουχιών σχεδόν-πλήρους μήκους γονιδιώματος έδειξαν ότι ο υπότυπος B είναι ο κυρίαρχος υπότυπος (61%), και ακολουθείται από τον υπότυπο A (23.3%), τον υπότυπο C (5.2%), τη CRF02_AG (3.9%) και τους υπότυπους D, CRF01_AE και CRF04_cpx (από 1.3%). Δύο HIV-1 στελέχη (2.6%), με προέλευση τη Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό (DRC) δεν ταξινομήθηκαν σε οποιονδήποτε γνωστό (υπο)υπότυπο ή μεταδιδόμενη ανασυνδυασμένη μορφή (CRF). Η ανάλυση ανασυνδυασμού και η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε ότι το ένα στέλεχος έχει ένα νέο, μοναδικό ανασυνδυασμένο πρότυπο, που περιλαμβάνει τμήματα των υποτύπων D και G και είναι διαφορετικό από οποιοδήποτε άλλο CRF ή URF αναφερόμενο μέχρι τώρα. Η λεπτομερής ανάλυση του δεύτερου άγνωστου στελέχους κατέδειξε ότι φυλογενετικά βρίσκεται κοντά στις αλληλουχίες αναφοράς του υπότυπου Κ, αλλά δεν ταξινομείται μέσα στον κλάδο Κ και ίσως είναι ένας υπο-υπότυπος του Κ ή νέος HIV-1 υπότυπος. Η συσχέτιση των φυλογενετικών στοιχείων με τις επιδημιολογικές πληροφορίες των ασθενών δείχνουν ότι, η HIV-1 λοίμωξη στην Κύπρο τροφοδοτείται από μια συνεχή είσοδο νέων στελεχών από άλλες χώρες τα τελευταία είκοσι χρόνια, καθιερώνοντας μια εξελισσόμενη και πολυφυλετική λοίμωξη στο νησί. Στην δεύτερη μελέτη, παρουσιάζεται μια μοριακή επιδημιολογική έρευνα, όπου διερευνήθηκε η γενετική ποικιλότητα και η μεταδιδόμενη ανθεκτικότητα ως προς την αντιρετροϊκή θεραπεία σε 37 στελέχη νεοδιαγνωσθέντων HIV-1 ασθενών που δεν υποβλήθηκαν σε αντιρετροϊκή θεραπεία κατά το διάστημα 2003-2006. Το RNA των κωδικών περιοχών gag, pol(PR-RT) και env πολλαπλασιάστηκε σε τρία nested RT-PCRs σε όλα τα HIV-1 δείγματα. Τα PCR προϊόντα αλληλουχήθηκαν και αναλύθηκαν φυλογενετικά. Παράλληλα, έγινε καθορισμός της επικράτησης της μεταδιδόμενης ανθεκτικότητας στα διαθέσιμα αντιρετροϊκά φάρμακα και της πρόγνωσης του κυτταρικού τροπισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο υπότυπος A είναι ο πιο κοινός υπότυπος (38%) μεταξύ των HIV-1 στελεχών των νεοδιαγνωσθέντων ατόμων στην περίοδο 2003-2006 και ακολουθεί ο υπότυπος B (35%), ο υπότυπος C (13%), η CRF02_AG (8%) και ο υπότυπος D και CRF01_AE (από 3%). Δύο HIV-1 οροθετικά άτομα είχαν μια αμινοξική αντικατάσταση στο γονίδιο της αντίστροφης μεταγραφάσης (RT) (>25% των HIV-1 quasispecies) που συνδέεται με υψηλού επιπέδου ανθεκτικότητα στους RT αναστολείς. (…)

Two newly diagnosed untreated HIV-1 patients had an amino acid substitution in the reverse transcriptase (RT) (>25% of the HIV-1 quasispecies) associated with high-level resistance to RT inhibitors. In the present dissertation the molecular heterogeneity of human immunodefieciency virus type 1 (HIV-1) was studied, focusing on effects of molecular evolution on the natural heterogeneity of the viral genome and the selective pressure by antiretroviral drugs. For the achievement of this objective, three individual studies were carried out, in which samples from HIV-1 seropositives diagnosed in Cyprus from 1986 up onwards were used. The molecular epidemiology of HIV-1 infection was first studied in Cyprus in the mid-1990s but the extent of HIV-1 diversity has remained indefinable for the last 20 years. In an effort to address this issue, a retrospective study was conducted in order to investigate the genetic dissemination of HIV-1 virus and to determine the dynamics of the epidemic in Cyprus. Strains isolated from 77 HIV-1 infected individuals, representing 38% of the known infected population in Cyprus in the period from 1986 to 2006 were examined. RNA of the near-full length genome was amplified with four nested RT-PCRs in all HIV-1 samples and sequenced using a new protocol. Detailed phylogenetic and recombination analyses were conducted for the classification of the samples. The results of the phylogenetic analysis of the HIV-1 near-full lenth sequences showed that subtype B is the dominant subtype (61%) and is followed by A (23.3%), C (5.2%), CRF02_AG (3.9%) and D, CRF01_AE and CRF04_cpx (1.3% each). Two HIV-1 strains (2.6%), originating from the Democratic Republic of Congo (DRC) could not be classified in any known (sub)subtype or circlulating recombinamt form (CRF). Recombination and phylogenetic analysis showed that one of the unknown strains reveals a new, unique recombinant pattern, which includes segments of subtype D and G and is different from any other CRFs or URFs reported so far. Detail analysis of the second unknown strain showed that it is phylogenetically close to subtype K reference strains, but does not classify with K and perhaps is a new HIV-1 subtype or (sub)subtype of K. Cross-correlation of the phylogenetic data with the patient´s epidemiological data demonstrated that HIV-1 infection in Cyprus is being fueled by a continuous entry of new strains from other countries over the past twenty years, establishing an evolving and polyphyletic infection in the island. In the second study, molecular epidemiological research is represented, where we investigated the genetic diversity and transmitted drug resistance against antiretroviral drugs in 37 strains of newly diagnosed naive HIV-1 patients during 2003-2006. The RNA of the gag, pol(PR-RT) and env coding regions was amplified with three nested RT-PCRs in all samples. The PCR products were sequenced and analyzed phylogenetically. At the same time, the amplified products were studied to determine the prevalence of drug-resistance-associated mutations and to prognosticate the co-receptor tropism. The results showed that subtype A was the most common subtype present (38%) among the 37 HIV-1 strains of newly diagnosed untreated HIV-1 patients, followed by subtype B (35%), C (13%), CRF02_AG (8%) and D and CRF01_AE (3% each). (...)