Λειτουργικός χαρακτηρισμός της ανθρώπινης πυρηνικής πρωτεϊνης hCINAP

Abstract

Η παρούσα ερευνητική διδακτορική διατριβή επιζητεί τον λειτουργικό χαρακτηρισμό της νέας, μερικώς χαρακτηρισμένης ανθρώπινης πυρηνικής πρωτεΐνης, hCINAP (human Coilin Interacting Nuclear ATPase Protein). Η hCINAP πρωτοανακαλύφθηκε μέσω του συστήματος των δύο υβριδίων στο ζυμομύκητα, καθώς βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη coilin, συστατικό των σωματιδίων Cajal (CBs), ενδοπυρηνικών δομών που δρουν ως χώροι συναρμολόγησης και ωρίμανσης πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλεγμάτων. Η hCINAP παρουσιάζεται φυλογενετικά συντηρημένη στα κύρια ευκαρυωτικά φύλα. Αν και έχει οριστεί ως αδενυλική κινάση (ΑΚ6), εμφανίζει ασυνήθιστα ευρεία εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, δομικά χαρακτηριστικά της οικογένειας των ATPασών/GTPασών (μοτίβα Walker A και Β) και διπλή ενεργότητα ΑΚ/ΑΤΡάσης. Παρουσιάζει διάχυτη πυρηνοπλασματική κατανομή, εξαιρετέου του πυρηνίσκου και σπανίως εντοπίζεται στα ίδια τα CBs. Υπερέκφραση της σε κύτταρα HeLa με παροδική επιμόλυνση, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των CBs/πυρήνα, υποδηλώνοντας πως η αλληλεπίδραση hCINAP-coilin επηρεάζει τη συγκρότηση των σωματιδίων αυτών. Με βάση την υφιστάμενη γνώση, στόχος της εργασίας μου ήταν ο περαιτέρω χαρακτηρισμός της hCINAP, για τη κατανόηση του λειτουργικού ρόλου που επιτελεί στον ευκαρυωτικό πυρήνα. Η hCINAP κωδικοποιείται ως εναλλακτικό μεταγράφημα από τον γενετικό τόπο TAF9 έχοντας κοινά τα δύο πρώτα εξόνια με τον μεταγραφικό παράγοντα TAFIID32, χωρίς όμως πρωτεϊνική ομοιότητα. Τα μεταγραφήματα των TAFIID32 και hCINAP, εκφράζονται σε στοιχειομετρία 1:1 σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς και κυτταροσειρές που εξετάστηκαν. Η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών hCINAP και coilin επιβεβαιώθηκε με πειράματα συν-επιλογής και η χαρτογράφηση της περιοχής αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών, ανέδειξε τα 215 καρβοξυτελικά κατάλοιπα της coilin. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η ταυτοποίηση πρωτεϊνών που παρουσιάζουν φυσική αλληλεπίδραση με την hCINAP με δύο in vivo τεχνικές μαζικής σάρωσης πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων: α) σάρωση cDNA βιβλιοθήκης από κύτταρα HeLa, με χρήση του συστήματος των δύο υβριδίων στο ζυμομύκητα και β) συνδυαστική τεχνική SILAC/φασματοσκοπία μάζας. Αυτές αποκάλυψαν αριθμό υποψήφιων πρωτεϊνικών στόχων που επιχειρήθηκε να επιβεβαιωθούν περαιτέρω. Κατασκευάστηκε σταθερά μετασχηματισμένη κυτταροσειρά HeLaGFP-hCINAP, χαρακτηρίστηκε και χρησιμοποιήθηκε σε σειρά in vivo πειραμάτων. Μέσω FRAP προέκυψε ότι η hCINAP διαχέεται ελεύθερα στον πυρήνα (t1/2=0.29±0.03s) και ποσοστό της (11%±4) είναι σταθερά προσδεδεμένη. Επιπλέον, μελετήθηκε φαινοτυπικά κατά τη διάρκεια της μίτωσης με τεχνική μικροσκοπίας πραγματικού χρόνου. Τόσο η ενδογενής hCINAP όσο και η GFP-hCINAP, μετά από μεταγραφική καταστολή της RNA pol.II, ανακατανέμονται στους δακτυλίους Dark Nucleolar Caps (DNCs) γύρω από τους πυρηνίσκους, όπου συνεντοπίζονται με την πρωτεΐνη των παραδιάστικτων σωματιδίων, PSP1. Ο συνεντοπισμός hCINAP/PSP1 παρατηρείται επίσης σε εστίες στον πυρήνα και στους πυρηνίσκους, μετά από έκθεση των κυττάρων σε ακτινοβολία UV-C. Τέλος, με βάση την δομή της hCINAP επιλέχθηκαν και μεταλλάχθηκαν συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα της, σημαντικά για τη δράση της ως ATPάσης (T17A και Η79G). Έκφραση των μεταλλαγμάτων σε κύτταρα HeLa, είχε ως αποτέλεσμα αλλαγή του μέσου όρου του αριθμού των CBs ανά κύτταρο και δραματική αλλαγή της κατανομής του αριθμού τους στον πληθυσμό, με κύτταρα που παρουσίαζαν είτε πολύ μικρό αριθμό (0-1 CB) είτε πολύ μεγάλο αριθμό (30 CBs) ανά πυρήνα. Επίσης παρατηρήθηκε τοξικότητα και μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα ευρήματα εισηγούνται πιθανή εμπλοκή της hCINAP σε μονοπάτια απόκρισης μετά από κυτταρικό στρες και στον έλεγχο της συναρμολόγησης και αποσυναρμολόγησης των CBs στους πυρήνες των ανθρώπινων κυττάρων.

The aim of this PhD thesis was the functional characterization of a novel, partially characterised human nuclear protein, termed as hCINAP (human Coilin Interacting Nuclear ATPase Protein). hCINAP was originally identified, using the yeast two-hybrid system, as a protein interacting with coilin, a marker of Cajal bodies (CB), nuclear organelles involved in the maturation of snRNPs and snoRNPs ribonucleoprotein complexes. hCINAP is highly conserved across its full-length in all species. Although previously designated as an adenylate kinase (AK6), its unusually broad substrate specificity, structural features characteristic of ATPase/GTPase proteins (Walker A and B motifs) and ATPase activity establish it as a dual-activity AK/ATPase. hCINAP exhibits a diffuse nucleoplasmic pattern, excluding nucleoli, with occasional concentration in CBs. Its transient overexpression in HeLa cells results in a decrease of the average number of CBs per nucleus, indicating that the functional interaction of hCINAP-coilin affects their assembly. Based on existing knowledge, the purpose of my thesis was to further characterise the functional role of hCINAP in the eukaryotic nucleus. The hCINAP mRNA is an alternatively spliced transcript from the TAF9 locus, sharing the first two exons with the basal transcription factor subunit TAFIID32, without having any similarities in their respective protein sequence. The TAFIID32 and hCINAP transcripts are stoichiometrically expressed in a 1:1 ratio in all human tissues and cell lines examined. The interaction between hCINAP and coilin was confirmed through in vitro co-selection experiments. The interacting domain was mapped within the 215 carboxy-terminal amino acids of coilin. Furthermore, the identification of additional hCINAP-interacting proteins was pursued, using two large scale in vivo techniques: (a) screening of a HeLa cDNA library, using the yeast two-hybrid system and (b) the combination of SILAC and mass spectrometry. These screens revealed a number of putative candidates that were further validated. A stable cell line HeLaGFP-hCINAP was constructed, characterised and used in a series of in vivo experiments. Using FRAP, hCINAP was shown to freely diffuse within the nucleus (t1/2=0.29±0.03) with only a small fraction (11%±4) binding to nuclear structures. The dynamic protein cycle was also monitored with time-lapse microscopy. Upon specific transcriptional inhibition of RNA pol.II, hCINAP or GFP-hCINAP segregates in perinucleolar Dark Nucleolar Caps (DNCs), where it co-localizes with the Paraspeckle protein 1 (PSP1). The co-segregation of these two proteins is also observed in nuclear and nucleolar foci formed upon UV-C irradiation. Finally, according to the solved structure of hCINAP, conserved amino acid residues, critical for its ATPase activity, were selected and point mutated (T17A and H79G). Expression of these mutants in HeLa cells resulted in the change of the mean number of CB per nucleus, as well as the dramatic change of their distribution within the population, having cells with either abnormally small (0-1 CB/cell) or high (30 CB/cell) number per nucleus. Moreover, toxicity and severe reduction of cell proliferation have been observed. Our combined findings suggest an involvement of hCINAP in stress response signalling pathways and in the pathway controlling the assembly and disassembly of CBs in the nucleus of human cells.