A study of galactosaemia in Cyprus : epidemiological, biochemical, molecular and cellular investigation

Abstract

Η κλασσική γαλακτοζαιμία είναι μια αυτοσωμική υπολειπόμενη διαταραχή του μεταβολισμού των υδατανθράκων η οποία οφείλεται σε μεταλλάξεις στο γονίδιο GALT και έχει σαν αποτέλεσμα την ανικανότητα του οργανισμού να μεταβολίσει τη γαλακτόζη. Η νόσος εκδηλώνεται στη βρεφική ηλικία με προβλήματα σίτισης, αναπτυξιακές διαταραχές, ηπατική δυσλειτουργία, αιμορραγία και σηψαιμία, και μπορεί να καταλήξει στο θάνατο αν ο ασθενής δε διαγνωσθεί έγκαιρα και υποβληθεί σε δίαιτα χωρίς γαλακτόζη. Εντούτοις, πολλοί ασθενείς οι οποίοι ακολουθούν πιστά την δίαιτα παρουσιάζουν προβλήματα στην ανάπτυξη, ομιλία, κινητική λειτουργιά, μάτια (καταρράκτη) και δυσλειτουργία των ωοθηκών στα κορίτσια. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης μελετήθηκε η γαλακτοζαιμία στον Κυπριακό πληθυσμό σε επιδημιολογικό, βιοχημικό, μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Η επιδημιολογική μελέτη περιλάμβανε 528 εθελοντές από όλη την Κύπρο και έδειξε ότι η συχνότητα των φορέων της κλασσικής γαλακτοζαιμίας στην Κύπρο είναι 1:88 που μεταφράζεται σε συχνότητα ασθενών 1 στις 31,000 γεννήσεις, παρόμοια με άλλους Ευρωπαϊκούς πληθυσμούς. Σε μοριακό επίπεδο ταυτοποιήθηκαν πέντε μεταλλάξεις, δύο από τις οποίες είναι καινούργιες. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει μια απάλειψη 8489 βάσεων η οποία περιγράφεται για πρώτη φορά και περιλαμβάνει όλα τα εξόνια του γονιδίου GALT και εκτείνεται στο διπλανό γονίδιο, IL11RA. Η συγκεκριμένη απάλειψη είναι η πιο συχνή μετάλλαξη κλασσικής γαλακτοζαιμίας στον Κυπριακό πληθυσμό με συχνότητα αλληλομόρφου 55%. Ενδιαφέρον είναι επίσης το γεγονός ότι όλοι οι φορείς της νέας μετάλλαξης έχουν κοινό απλότυπο και κατ’ επέκταση κάποιο κοινό πρόγονο. H νέα αυτή μετάλλαξη οδηγεί σε ταυτόχρονη ανεπάρκεια τόσο του ενζύμου GALT όσο και της άλφα αλυσίδας του υποδοχέα της ιντερλευκίνης 11, γεγονός που εξηγεί τις επιπλέον φαινοτυπικές ανωμαλίες που παρουσιάζονται σε ομόζυγους ασθενείς, όπως κρανιοσυνόστωση, ένα εύρημα που αποδίδεται στη δυσλειτουργία της IL11RA. Οι υπόλοιπες μεταλλάξεις που ταυτοποιήθηκαν είναι: η c.[378-12G>A] η οποία είναι επίσης καινούργια και οι ήδη γνωστές μεταλλάξεις p.Pro185Ser, c.[820+13A>G] και η p.Lys285Asn η οποία βρέθηκε να είναι η δεύτερη πιο συχνή μετάλλαξη στον κυπριακό πληθυσμό (30%). Η επιδημιολογική μελέτη ολοκληρώθηκε με τον έλεγχο για τον πολυμορφισμό Duarte, p.Asn314Asp, στο γενικό πληθυσμό ο οποίος βρέθηκε να έχει συχνότητα 8%. Με στόχο την κατανόηση των κυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεση της νόσου, μελετήθηκε κατά πόσο η έλλειψη του ενζύμου GALT και η συσσώρευση τοξικών μεταβολιτών της γαλακτόζης οδηγούν σε στρες στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ) ή/και σε οξειδωτικό στρες. Παρατηρήθηκε ότι, στην παρουσία γαλακτόζης, υπάρχει αυξημένη συσσώρευση του τοξικού μεταβολίτη 1-φωσφορική γαλακτόζη σε κυτταρικές σειρές που δημιουργήθηκαν από ασθενείς σε σύγκριση με φυσιολογικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας συγκριτική PCR πραγματικού χρόνου για την αξιολόγηση επιπέδων έκφρασης γονιδίων, προέκυψε ότι τα γονίδια ματισμένο XBP 1, BiP, CLNX, ATF 4 και ATF6 που αποτελούν δείκτες για στρες στο ΕΔ, παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης. Αντιθέτως, τα επίπεδα έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με οξειδωτικό στρες (SOD 2 και CAT) δεν παρουσίασαν σημαντική αύξηση. Το στρες στο ΕΔ προάγει τη διαδικασία της απόπτωσης και αυτή αξιολογήθηκε μετρώντας τα επίπεδα έκφρασης του προ-αποπτωτικού δείκτη Chop τα οποία βρεθήκαν αυξημένα σε κύτταρα ασθενών. Επίσης, η δοκιμή TUNEL επιβεβαίωσε αυξημένη απόπτωση στα κύτταρα ασθενών. Το ποσοστό απόπτωσης ήταν μεγαλύτερο σε ασθενείς ομόζυγους για τη νέα μετάλλαξη σε σχέση με ασθενείς ομόζυγους για τη p.Lys285Asn. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στη μειωμένη αντίδραση της IL11RA μέσω του μηχανισμού IL11RA/gp30 που προκαλεί η μεγάλη απάλειψη.

Classic galactosaemia is an autosomal recessive inborn error of carbohydrate metabolism, caused by mutations in the human galactose-1-phosphate uridyl transferase gene (GALT), which results in the inability to metabolize galactose. The disorder presents in infancy with feeding problems, failure to thrive, hepatocellular damage, bleeding, and sepsis and can result in death if the patient is not promptly diagnosed and put on a galactose-free diet. However, many well-treated patients following a galactose-restricted diet remain at an increased risk for developmental delay, speech problems, abnormalities of motor function, cataracts and premature ovarian failure in females. This project aimed to study galactosaemia in Cyprus at the epidemiological, biochemical, molecular and cellular level. In the epidemiological study 528 volunteers from all areas of Cyprus were included. The frequency of galactosaemia carriers in the general population was estimated at 1:88 which is similar to that found in other European populations and predicts a homozygote frequency of about 1:31,000 births. Through the molecular characterization of all Cypriot galactosaemic patients and carriers, five disease-causing mutations have been identified, two being novel. We have characterized a novel large deletion of 8489bp encompassing all exons of the GALT gene and further extending into the adjacent IL11RA gene. This is the predominant mutation for galactosaemia in our population occurring with an allele frequency of 55%. Microsatellite analysis revealed the presence of a common haplotype in all identified carriers for this mutation pointing to a founder effect. We further provide evidence that the new deletion affects both the GALT enzyme and the IL11RA protein resulting in classic galactosaemia with additional phenotypic abnormalities such as craniosynostosis, a feature that has been associated with defects in the IL11RA gene. The second novel deletion is the intronic transition c.[378-12G>A]. Three more known mutations were identified: p.Pro185Ser, c.[820+13A>G] and the p.Lys285Asn, which was found to be the second most frequent mutation in the Cypriot population (30%). In addition, we estimated the frequency of the Duarte variant, p.Asn314Asp, in Cyprus to be 8%. This project also aimed to contribute to the understanding of the cellular mechanisms which are involved in the pathogenesis of galactosaemia by investigating whether GALT enzyme deficiency and the accumulation of galactose toxic metabolites induce endoplasmic reticulum and/or oxidative stress. We observed that galactose challenge of patient cell lines resulted in the accumulation of galactose-1-phosphate compared to controls. By determining the gene expression level by means of real-time PCR we were able to show that the mRNA levels of spliced XBP 1, BiP, CLNX, ATF 4 and ATF 6, which are markers for ER stress, are elevated in patient cells whereas the levels of mRNA of the oxidative stress marker genes (CAT and SOD 2) do not appear to be significantly different from the levels of the control cells. ER stress, accelerates the apoptotic process and this was evaluated by measuring the expression levels of the pro-apoptotic marker Chop by real-time PCR. The levels of Chop were found increased in patient cells. Furthermore, TUNEL assay results suggest increased apoptosis in patient cell lines. Patients homozygous for the novel GALT 8.5 kb deletion show greater ER stress-induced apoptosis compared to patients homozygous for the p.Lys285Asn substitution. This could be explained by the arrest of the responsiveness of the IL11 through IL11RA/gp30 signaling caused by IL11RA deficiency associated with the deletion.