Addressing the molecular basis of morphogenetic movements during Xenopus gastrulation with the use of quantum dot nanocrystals : the role of Focal Adhesion Kinase (FAK) during Xenopus development

Abstract

Σε αυτή τη μελέτη αποδεικνύουμε ότι η ενεργοποίηση της FAK με βάση τις ιντεγκρίνες είναι απαραίτητη για τη μεσοδερμική μετανάστευση όχι όμως για τη συγκλίνουσα επέκταση. Η αναστολή της FAK με έκφραση του γνωστού αρνητικού ρυθμιστή (Dominant Negative) FRNK (Focal adhesion Related Non-Kinase), εμποδίζει τη μεσοδερμική εξάπλωση και μετανάστευση in vitro χωρίς όμως να επηρεάζει τη συγκλίνουσα επέκταση τονίζοντας τις μοριακές διαφορές των δύο αυτών κινήσεων. Για να μελετηθούν οι επιπτώσεις της αναστολής της FAK in vivo, αναπτύξαμε μια νέα μεθοδολογία βασισμένη στη χρήση των NIR QD’s η οποία επέτρεψε για πρώτη φορά την in vivo απεικόνιση των κινήσεων σε βαθιούς ιστούς στο Xenopus laevis με ανάλυση μοναδικού κυττάρου. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση αποδείξαμε ότι η FAK είναι απαραίτητη στη μεσοδερμική μετανάστευση in vivo και παρέχουμε in vivo ποσοτικά δεδομένα ως προς τον ρυθμό μετανάστευσης και απόκτησης κατεύθυνσης του μεσοδέρματος. Αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν τη FAK ως ένα σημαντικό ρυθμιστή της μορφογένεσης στο Xenopus και αποδεικνύουν την χρησιμότητα της μεθοδολογίας των NIR QD’s. Ο ουσιαστικός ρόλος της FAK στη μεσοδερμική μετανάστευση αποτέλεσε ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου αυτής της κίνησης κατά τη διαδικασία της γαστριδίωσης ως σύνολο και για να συμπεράνουμε ότι η μεσοδερμική μετανάστευση είναι απαραίτητη για το επιτυχές κλείσιμο του βλαστοπόρου στο Xenopus. Τα αποτελέσματά μας, υποστηρίζουν περαιτέρω στα ήδη προϋπάρχοντα στοιχεία που εμπλέκουν τη FAK στη θετική ρύθμιση της κυτταρικής εξάπλωσης και μετανάστευσης. Στη συνέχεια δείξαμε ότι η ενεργοποιημένη φωσφορυλιωμένη FAK σε κατάλοιπα τυροσίνης εντοπίζεται κυρίως στην πλασματική μεμβράνη των βλαστομερών των εμβρύων σε στάδια βλαστιδίου και γαστριδίου, υποδηλώνοντας ότι η FAK ενεργοποιείται στην πλασματική μεμβράνη και ίσως αυτή η ενεργοποίηση να γίνεται με μηχανισμούς ανεξάρτητων των ιντεγκρινών, τουλάχιστον πριν τη γαστριδίωση. Δημιουργήθηκαν διάφορα μεταλλαγμένα μόρια της FAK και εξετάστηκαν για τον εντοπισμό τους έτσι ώστε να χαρτογραφήσουμε ποια περιοχή της FAK είναι υπεύθυνη για τον μεμβρανικό της εντοπισμό in vivo. Αυτή η σειρά των πειραμάτων αποκάλυψε ότι το αμινοτελικό άκρο-περιοχή FERM είναι αναγκαίο και ικανό για τον μεμβρανικό εντοπισμό της FAK σε περιοχές ελεύθερες από ιντεγκρίνες. Παραδόξως, υπερέκφραση της περιοχής FERM σε έμβρυα του Xenopus laevis οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης της FAK σε κατάλοιπα τυροσίνης και των υποστρωμάτων της με κυτταρικά αυτόνομο αλλά εξαρτώμενο τρόπο από τη Src. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ένα νέο ρόλο της περιοχής FERM ως ενεργοποιητή της FAK. Επιπλέον, τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν τον ουσιαστικό ρόλο της θέσης αυτοφωσφορυλίωσης της FAK, τυροσίνη 397, στην κυτταρική εξάπλωση και μετανάστευση, και υποδηλώνουν ένα πιθανό ρόλο της FAK στην πολικότητα του μεσοδέρματος. Τελειώνοντας, δείξαμε ότι και το αμινοτελικό και το καρβοξυτελικό άκρο της FAK απαιτούνται για τη στόχευση της στην πλασματική μεμβράνη στο μορφογενετικά ενεργό ραχιαίο μεσόδερμα. Λόγω αυτών των ευρημάτων σχεδιάσαμε ένα νέο μεταλλαγμένο μόριο FAK που είναι ένα υποσχόμενο dominant negative. Χρησιμοποιώντας αυτό το υποθετικό dominant negative σε διάφορες in vivo και in vitro δοκιμασίες αποκαλύψαμε ότι η FAK είναι απαραίτητη στη μορφογένεση, επηρεάζοντας τόσο κινήσεις βασισμένες στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρου και εξωκυττάριου υποστρώματος όσο και μεταξύ κυττάρων, αλλά και ότι έχει ουσιαστικό ρόλο στη διαδικασία της μίτωσης.

We now show that integrin based FAK activity is necessary for mesoderm migration but not convergent extension. Inhibition of FAK by overexpression of the bona fide dominant negative FRNK (Focal adhesion Related Non-Kinase), blocks mesoderm spreading and migration both in vitro without affecting convergent extension highlighting the molecular differences between the two movements. In order to address the effects of blocking FAK in vivo we developed NIR QD based methodology which for the first time allowed in vivo visualization of deep movements in Xenopus laevis with single cell resolution. Using this approach we show that FAK is necessary for mesoderm migration in vivo and we provide quantitative in vivo data regarding migration rates and directionality of the mesoderm. These results implicate FAK as an important regulator of morphogenesis in Xenopus and demonstrate the power of the NIR QD methodology. The essential role of FAK in mesoderm migration provided us with a tool with which to address the role of this movement during the process of gastrulation as a whole and to conclude that mesoderm migration is necessary for successful closure of the blastopore in Xenopus. Our results add to a growing body of evidence implicating FAK as a positive regulator of cell spreading and migration. We go on to show that active tyrosine phoshorylated FAK is primarily found on the plasma membrane of blastomeres in both blastula and gastrula embryos suggesting that FAK becomes activated on the plasma membrane and that FAK may be activated via integrin-independent mechanisms at least prior to gastrulation. In an effort to identify the region of FAK responsible for membrane localization in vivo several mutants were generated and examined for their localization. These experiments revealed that the N-terminal FERM domain is both necessary and sufficient for plasma membrane localization of FAK in integrin-free regions of the plasma membrane. Interestingly, expression of the FERM domain in Xenopus laevis embryos leads to elevated tyrosine phosphorylation of endogenous FAK and of downstream targets in a cell autonomous and Src-dependent manner. These data reveal a new role for the FERM domain as an activator of FAK. In addition, our findings confirm an essential role of the FAK autophosphorylation site Tyr397 on cell spreading and migration and also suggest a possible role for FAK in mesodermal patterning and polarity. Finally, we show that both the N- and C- termini of FAK are required for FAK targeting to the plasma membrane in the highly morphogenetic dorsal mesoderm and generated a new promising dominant negative construct designed upon these findings. Using this putative dominat negative construct in several in vivo and in vitro assays with we reveal that FAK is necessary for morphogenesis, affecting both cell-extracellular matrix and cell-cell based movements of the mesoderm, in addition to an essential role in mitosis.