Ταυτοποίηση και λειτουργικός χαρακτηρισμός μιας νέας πρωτεϊνης τύπου Κατανίνης, KATNAL2, σε κύτταρα ποντικού

Abstract

Η Katanin αποτελεί μία φυλογενετικά ευρέως διαδεδομένη και καλά χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη που ταξινομείται στην υπεροικογένεια των ΑΑΑ ATPάσων και χαρακτηρίζεται από τη δράση της ως ένζυμο κατάτμησης των μικροσωληνίσκων, συμμετέχοντας σε ποικίλες κυτταρικές διεργασίες όπως η μίτωση. Παράλληλα, σε διάφορους οργανισμούς έχει εξακριβωθεί η παρουσία συγγενικών πρωτεϊνών της Katanin, τύπου Katanin-like, που η λειτουργία τους παραμένει σχετικά ανεξερεύνητη. Στα πλαίσια της διατριβής, απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν πέντε ισομορφές τύπου Katanin-like 2 (Katnal2) από κυτταροσειρά ινοβλαστών ποντικού. Τα mRNAs των ισομορφών έχουν διαφορετικά μεγέθη (Katnal2-L1: 1617 bp, L2: 1611 bp, L3: 1518 bp, S1: 1215 bp, S2: 1116 bp), αποτελώντας προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος των εξωνίων της γονιδιακής θέσης που τις κωδικοποιεί (χρωμόσωμα 18). Η ανάλυση του τοπικού και αναπτυξιακού προτύπου γονιδιακής έκφρασης κατέδειξε ότι οι Katnal2 είναι εμπλουτισμένες σε ιστούς με έντονη μιτωτική δραστηριότητα. Κατασκευάστηκε και χαρακτηρίστηκε πολυκλωνικό αντίσωμα ειδικό έναντι της οικογένειας ισομορφών KATNAL2. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε συνδυασμό με φασματοσκοπία μάζας επαλήθευσαν την παρουσία των πρωτεϊνών αυτών και ταυτόχρονα αποκάλυψαν πιθανές αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες, που περιλάμβαναν ριβοσωμικές πρωτεΐνες και μοριακές συνοδούς (chaperones). Πειράματα ανοσοφθορισμού για τη μελέτη του ενδοκυτταρικού εντοπισμού των ισομορφών φανέρωσαν ότι στη μεσόφαση οι KATNAL2 βρίσκονται κυρίως στους μικροσωληνίσκους και στα κεντροσωμάτια. Κατά τα αρχικά στάδια της μίτωσης εμπλουτίζονται στα κεντροσωμάτια και στους πόλους της ατράκτου, στη συνέχεια επεκτείνονται στους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής συσκευής, ενώ κατά την κυτοκίνηση ανιχνεύονται και στο ενδιάμεσο σώμα (midbody). Ακόμη συνεντοπίζονται με το βασικό σωμάτιο και το αξόνημα των μονήρων αισθητήριων βλεφαρίδων (cilia). Κλάσμα των KATNAL2 συναντάται στον πυρηνίσκο, όπου συνεντοπίζονται με την μεθυλτρανσφεράση Φιμπριλλαρίνη υπό κανονικές συνθήκες αλλά και υπό συνθήκες μεταγραφικής αναστολής όταν οι δύο πρωτεΐνες ανακατανέμονται στους περί-πυρηνισκικούς δακτυλίους γνωστούς ως LNC (Light Nucleolar Centres). Διαμεσολαβούμενη από shRNA σταθερή αποσιώπηση των Katnal2 είχε ως συνέπεια την επαγωγή ιδιαίτερα σοβαρών φαινοτύπων που χαρακτηρίζονταν από σημαντική μεγέθυνση των κυττάρων και των πυρήνων τους, την παρουσία υπεράριθμων κεντριδίων σε όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου με επακόλουθο την δημιουργία ανώμαλων πολυπολικών μιτωτικών ατράκτων, την ανάδειξη ανωμαλιών κατά τη μίτωση και την κυτοκίνηση, την αυξημένη εμφάνιση γεφυρών χρωματίνης και διπύρηνων κυττάρων, τη διαφοροποίηση του φυσιολογικού προτύπου του κυτταρικού κύκλου ειδικά στις φάσεις S και G2, και την αυξημένη παρουσία ακετυλιωμένων μακρών και σταθερών μικροσωληνίσκων. Τέλος, σε αποσιωπημένους για τις KATNAL2 πληθυσμούς, καταγράφηκε ελάττωση του ποσοστού των βλεφαριδοφόρων κυττάρων. Παράλληλα, στο εργαστήριο μας, μέσω πειραμάτων συνεπιλογής, αποδείχθηκε ότι οι ισομορφές KATNAL2-L1 και KATNAL2-S1 αλληλεπιδρούν τόσο με τον εαυτό τους όσο και με άλλες ισομορφές. Επίσης διαφάνηκε ότι οι ισομορφές L1 και S1 αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες Nubp1 και Nubp2, που αποτελούν αρνητικούς ρυθμιστές της βλεφαριδογένεσης και συμμετέχουν στο μηχανισμό ρύθμισης διπλασιασμού των κεντροσωματίων (Christodoulou et al., 2006, Kypri et al., 2014), δίδοντας τα πρώτα στοιχεία για τους μοριακούς μηχανισμούς στους οποίους συμμετέχουν οι KATNAL2, στις διαδικασίες που αναδείκτηκαν από τα πειράματα αποσιώπησης. Συμπερασματικά, οι KATNAL2 αποτελούν πολυλειτουργικές πρωτεΐνες, οι οποίες εμπλέκονται σε διεργασίες που επηρεάζουν τη δυναμική οργάνωση των μικροσωληνίσκων, τη ρύθμιση του αριθμού των κεντριδίων, την κυτοκίνηση, τη βλεφαριδογένεση, το κυτταρικό και πυρηνικό μέγεθος και σχήμα ενώ πιθανόν να εμπλέκονται και σε διεργασίες που εδράζονται στον πυρηνίσκο.

Katanin is a phylogenetically conserved and well characterized microtubule (MT)-severing AAA protein, which has been implicated in various cellular functions including mitosis. In parallel, several organisms also encode a number of closely related katanin-like proteins (KATNAL1s and KATNAL2s), whose activities remain relatively underexplored. We have cloned and identified five novel katanin-like 2 proteins (KATNAL2) from mouse NIH3T3 fibroblast cells. The mRNAs of these isoforms have different sizes (L1: 1617 bp, L2: 1611 bp, L3: 1518 bp, S1: 1215 bp and S2: 1116 bp) and are products of differential mRNA splicing of the 16 exons constituting the Katnal2 genomic locus on mouse chromosome 18. Analysis by RT-PCR revealed that Katnal2 isoforms are ubiquitously expressed and under developmental regulation in specific tissues associated with elevated mitotic activity. We generated and characterized a goat polyclonal antibody (anti-KATNAL2), specifically recognizing all five KATNAL2 isoforms and confirmed the presence of KATNAL2s in mouse tissues through immunoprecipitation experiments coupled with mass spectrometric analysis. Additionally, various putative KATNAL2-interacting partners were identified, including ribosomal and molecular chaperone proteins. Immunofluorescence analysis using the designed antibody in various mouse cell lines, indicated that at interphase KATNAL2s are associated with MTs in a detergent-resistant manner and localized at the centrioles of centrosomes. In mitotic cells, immunoreactivity was enriched at the centre of the two MT asters at the onset of mitosis and through to prometaphase, extended to spindle MT in later mitotic stages, and concentrated on the midbody in cytokinesis. KATNAL2 isoforms were also present at the basal body and axoneme of the solitary sensory cilia formed upon cell cycle exit. Notably, a fraction of immunoreactivity was found inside nucleoli and co-localized with the methyltransferase protein Fibrillarin; upon drug-induced transcriptional inhibition Fibrillarin & KATNAL2 were still associated and co-segregated in perinucleolar caps known as Light Nucleolar Centres (LNCs). shRNA-mediated stable silencing of Katnal2, induced severe cellular phenotypes consisting of significant enlargement of cellular and nuclear size, supernumerary centrioles throughout the cell cycle that led to the formation of multipolar mitotic spindles, the manifestation of mitotic and cytokinesis defects, the formation of chromatin bridges, the acquisition of binuclearity, an increased incidence of acetylation of the MT network, and an altered cell cycle pattern, especially during phases S and G2. KATNAL2 downregulation also markedly decreased the percentage of ciliated cells within the silenced population. Pull-down co-selection assays conducted in our lab, demonstrated that KATNAL2-L1 and KATNAL2-S1 are able to interact with themselves and with other KATNAL2 isoforms. Additionally KATNAL2s directly interact with Nubp1 or Nubp2 proteins, previously shown to be negative regulators of ciliogenesis (Kypri et al., 2014) and also involved in the regulation of centrosome duplication (Christodoulou et al., 2006). In conclusion, the novel KATNAL2s are multifunctional proteins involved in critically important processes affecting centriole arithmetics, MT dynamics, cytokinesis, cellular and nuclear size and ciliogenesis and are also implicated in cell cycle progression.