The role of N-alpha terminal acetyltransferase NAT4 in the regulation of gene expression in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Η Ν-άλφα-τελική ακετυλίωση είναι μια από τις πιο κοινές συντηρημένες τροποποιήσεις πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα, η οποία εμφανίζεται επίσης και σε ιστόνες. Διακρίνεται από τις υπόλοιπες τροποποιήσεις καθώς εντοπίζεται στην Ν-άλφα-αμινομάδα του πρώτου υπολείμματος αντί στην πλευρική αλυσίδα των αμινοξέων. Η Ν-αλφα-τελική ακετυλίωση της ιστόνης (Ν-acH4) καταλύεται από την Ν-τελική ακετυλοτρανσφεράση (Nat4). Παρά το γεγονός ότι, έχουν ήδη εξακριβωθεί βιολογικοί ρόλοι της Nat4 στο ζυμομύκητα (Saccharomyces cerevisiae) καθώς και στον άνθρωπο, η μοριακή λειτουργία του Ν-acH4 δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί. Στην παρούσα μελέτη αποδεικνύουμε ότι η Ν-acH4 είναι ένας νέος ρυθμιστής της μεθυλίωσης της αργινίνης 3 στην ιστόνη 4 Η4 καθώς και της αποσιώπησης της χρωματίνης στο ζυμομύκητα. Η σημαντικότητα των αποτελεσμάτων μας επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η συνεργιστική επικοινωνία μεταξύ Ν-acH4 και της εσωτερικής ακετυλίωσης ιστόνης σε λυσίνες 5, 8 και 12 ενισχύει έντονα την εναπόθεση της ασύμμετρης διμεθυλίωσης της αργινίνης (H4R3me2a) καθώς και την αποσιώπηση του ριβοσωμικού DNA (rDNA). Ως εκ τούτου μειώνεται σημαντικά η ανάπτυξη του ζυμομύκητα, η οποία μπορεί να διασωθεί μεταλλάσσοντας την αργινίνη 3 προς λυσίνη (H4R3K), γεγονός το οποίο καταδεικνύει ότι η ανώμαλη εναπόθεση μιας ενιαίας τροποποίησης ιστόνης μπορεί να έχει επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη. Ακολούθως, αποδείξαμε ότι η επικοινωνία μεταξύ Ν-acH4 και H4R3me2a στη ρύθμιση της αποσιώπησης του rDNA προκαλείται υπό συνθήκες θερμιδικού περιορισμού (CR). Προκειμένου να προσδιοριστεί αν η Nat4 ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίων εκτός από το ριβοσωμικό DNA πραγματοποιήσαμε RNA- αλληλούχιση, και εντοπίσαμε μια ομάδα γονιδίων που η έκφραση τους είναι σημαντικά αυξανόμενη όταν η δραστηριότητα της Nat4 χάνεται. Είναι ενδιαφέρον ότι, κάποια από αυτά τα γονίδια συμβάλουν στον μεταβολισμό, και κάποια γονίδια συσχετίζονται με συνθήκες στρες που επάγονται ισχυρά υπό συνθήκες CR. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι η έλλειψη Nat4 μιμείται συνθήκες CR. Βασιζόμενοι σε μελέτες γήρανσης, γνωρίζουμε ότι σε συνθήκες CR η διάρκεια ζωής του ζυμομύκητα αυξάνεται. Επομένως, θέλαμε να προσδιορίσουμε αν η απουσία της Nat4 επίσης αυξάνει τη μακροζωία (RLS) του ζυμομύκητα. Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν ότι η απώλεια της Nat4 επεκτείνει την μακροζωία σε παρόμοια επίπεδα με την CR και η διαγραφή της Nat4 σε συνδυασμό με CR δεν έχει καμία πρόσθετη επίδραση στη μακροζωία, υπονοώντας μια επιστατική επίδραση. Επιπλέον, η επέκταση της διάρκειας ζωής κατά την διαγραφή της Nat4 διαμεσολαβείται από την απώλεια της Η4 Ν-τελικής ακετυλίωσης, καθώς η απώλεια αυτής της τροποποίησης μεταλλάσσοντας την σερίνη 1 στην ιστόνη Η4 σε ασπαρτικό οξύ (H4S1D) οδηγεί σε παράταση της μακροζωίας. Σύμφωνοι με αυτό, δείχνουμε ότι η αργινίνη 3 επί ιστόνης Η4 (H4R3) απαιτείται για την επέκταση της μακροζωίας στον ζυμομύκητα καθώς επίσης και για την Nat4 μεσολαβούμενη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη αποκάλυψαν ένα νέο ρόλο της Nat4 στη ρύθμιση τόσο της ετεροχρωματινικής όσο και της ευχρωματινικής έκφρασης γονιδίων στο γονιδίωμα του ζυμομύκητα.

N-alpha-terminal acetylation is one of the most common and conserved post-translational modifications in eukaryotes, occurring on 60-70% of proteins. This modification also exists on histone proteins but is distinct from the numerous other histone modifications identified so far because it is deposited on the N-alpha amino group of the first residue instead of the side-chain of amino acids. The enzyme catalyzing histone N-alpha terminal acetylation was first identified in yeast and was named N-terminal acetyltransferase 4 (Nat4). Although other groups have provided insight about the biological role of yeast Nat4 and its human ortholog (Naa40), the molecular function of histone N-terminal acetylation has not been studied before. Our results suggest that N-terminal acetylation of histone H4 (N-acH4) is a novel regulator of histone arginine methylation and chromatin silencing in Saccharomyces cerevisiae. Importantly, we show that synergistic communication between N-acH4 and internal histone acetylation at lysines 5, 8 and 12 strongly enhances the deposition of asymmetric arginine dimethylation (H4R3me2a) and ribosomal DNA silencing. This leads to a severe growth defect that is remarkably rescued by mutating arginine 3 to lysine (H4R3K), pointing out that abnormal deposition of a single histone modification can have an effect on cell growth. Notably, we reveal that the cross-talk between N-acH4 and H4R3me2a in regulating rDNA silencing is induced under calorie restriction (CR) conditions. In order to determine whether Nat4 regulates gene expression beyond the ribosomal DNA locus, we performed RNA-sequencing (RNA-seq) and have identified a group of genes that are significantly upregulated when Nat4 activity is lost. Interestingly, these are metabolic and stress response genes that are highly induced under CR conditions. This result suggests that lack of Nat4 mimics CR and consistent with this we found that loss of Nat4 extends replicative lifespan (RLS) in yeast to similar levels as CR. Additionally, deletion of Nat4 in combination with CR does not have an additive effect on longevity implying an epistatic relationship between Nat4 and CR. This is further indicated by the fact that Nat4 expression and its activity are strongly repressed under CR. Accordingly, the extension in longevity upon Nat4 deletion is mediated by loss of H4 N- terminal acetylation since loss of this modification by mutating histone H4 serine 1 to aspartate (H4S1D) results in an extension in lifespan. Furthermore, we show that arginine 3 on histone H4 (H4R3) is required for the extension of RLS as well as for the Nat4- mediated regulation of gene expression. Collectively, the findings within this study reveal a novel role of Nat4 in regulating both heterochromatic and euchromatic gene expression in the yeast genome.