Ets2 gene function in trophoblast : in vivo and stem cell studies

Abstract

Η συγκεκριμένη μελέτη είχε στόχο την περαιτέρω κατανόηση, της ελάχιστα κατανοητής αλλά και κλινικά σημαντικής γενετικής βάσης στην ανάπτυξη του τροφοβλάστη του πλακούντα. Ο τροφοβλαστης του πλακούντα αποτελεί μια ομάδα κυτταρικών τύπων που προέρχονται από το εξωεμβρυονικό εκτόδερμα [(extraembryonic ectoderm (EXE)]. Το τελευταίο είναι ένας πληθυσμός βλαστικών κυττάρων τροφοβλάστη (TS) που προέρχεται από το πολικό τροφεκτόδερμα της βλαστοκύστης πριν από το στάδιο εμφύτευσης. Η τροφοβλάστη του πλήρως λειτουργικού (ώριμου) πλακούντα προωθεί την ανάπτυξη και βιωσιμότητα του εμβρύου καθώς και την υγεία της μητέρας, μέσω ρυθμίσεως των εμβρυομητρικών αλληλεπιδράσεων. Κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης του εμβρύου μετά την εμφύτευση, μέρος του EXE δημιουργεί τον εκτοπλακουντικό κώνο [ectoplacental cone (EPC)] , που μαζί με το ΕΧΕ αποτελούν τον προ - πλακούντα, τον πρόγονο του ώριμου πλακούντα. Το γονίδιο Ets2 κωδικοποιεί για ένα μέλος της οικογενείας μεταγραφικών παραγόντων Ets, του οποίου η έκφραση περιορίζεται στο EXE και EPC. Προηγούμενα πειράματα με Ets2 knockout ποντίκια [με "εκτοπισμένο" γονίδιο Ets2 (gene knockout)] in vivo, και σε κύτταρα TS in vitro, έδειξαν ότι το Ets2 χρειάζεται για τη διατήρηση του EΧΕ χαρακτήρα και για την αυτο-ανανέωση των TS κυττάρων. Το έργο αυτό εξέτασε αρκετές ανεξερεύνητες πτυχές όσον αφορά τη συμμετοχή του Ets2 στην ανάπτυξη του τροφοβλάστη. Πρώτον, αν και το Ets2 εκφράζεται στον προ- πλακούντα, η έκφραση του στον ώριμο πλακούντα δεν έχει διερευνηθεί. Η εργασία αυτή δείχνει για πρώτη φορά ότι η έκφραση Ets2 δεν περιορίζεται στον τροφοβλάστη του προ- πλακούντα, αλλά εντοπίζεται με ένα δυναμικό τρόπο και στoν τροφοβλάστη του ώριμου πλακούντα, υποδηλώνοντας επιπρόσθετους ρόλους για αυτό το γονίδιο στην ανάπτυξη ή / και τη λειτουργία του τροφοβλάστη. Δεύτερον , μια προηγούμενη μελέτη στα κύτταρα TS, έδειξε ότι το Ets2 χρειάζεται για την αυτο-ανανέωση των TS κυττάρων, όμως εάν το Ets2 συμμετέχει επίσης και στη διαφοροποίηση των TS κυττάρων, απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση. Για το σκοπό αυτό, η συγκεκριμένη μελέτη καθιέρωσε το πρώτο σύστημα βασιζόμενο σε λεντι-ιό για τη διερεύνηση της λειτουργίας γονιδίων στα κύτταρα TS μέσω αποσιώπησης γονιδίου, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί για να δειχθεί ότι το Ets2 στα κύτταρα TS προωθεί επίσης την διαφοροποίηση τους σε γιγαντιαία τροφοβλαστικά κύτταρα [ trophoblast giant cells (TGCs )] και κύτταρα συνδετικής τροφοβλαστικής ζώνης [junctional zone trophoblasts (JZTs)] τα οποία in vivo προέρχονται από το EPC. Τρίτον, παρόλο που ο φαινότυπος του τροφοβλάστη του προ – πλακούντα των Ets2 μεταλλαγμένων εμβρύων, τα οποία πεθαίνουν πριν από τα μέσα της κύησης έχει περιγραφεί προηγουμένως in vivo, πολλές πτυχές αυτού παραμένουν ακόμα ανεξερεύνητες . Για παράδειγμα, είναι αβέβαιο αν το Ets2 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του EPC και των TGC ή αν υπάρχουν διαφορές στην μη-EXE περιοχή του τροφοβλάστη μεταξύ των δύο διαφορετικών φαινοτύπων των Ets2 μεταλλαγμένων εμβρύων (τύπου-Ι και τύπου-ΙΙ φαινοτύποι). Το έργο αυτό επανεξέτασε τα συγκεκριμένα μεταλλαγμένα έμβρυα και αποκαλύπτει ότι και στους δύο τύπους , το Ets2 προάγει τον σχηματισμό JZTs και δευτερογενών TGCs, αλλά όχι των πρωτογενών TGCs. Αποδεικτικά στοιχεία προβάλλονται για το ότι ο μηχανισμός για αυτό το νέο ρόλο του Ets2 είναι διαφορετικός μεταξύ των τύπου Ι και τύπου II Ets2 μεταλλαγμένων εμβρύων. Συνολικά, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης παρέχουν ένα νέο ερευνητικό εργαλείο για τη μελέτη της λειτουργίας γονιδίων στα κύτταρα TS , νέα δεδομένα για την έκφραση και το ρόλο του Ets2 γονιδίου κατά την ανάπτυξη του προ-πλακούντα και του πλακούντα και τέλος, στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο προ-πλακούντας των ποντικών αναπτύσσεται σε χαμηλά επίπεδα οξυγόνου, ομοίως με την κατάσταση στους ανθρώπους.

This work was about advancing the understanding of the poorly understood and clinically important genetic basis of the development of placental trophoblast, a group of cell types that originate from extraembryonic ectoderm (ExE). The latter is a trophoblast stem (TS) cell population derived from the polar trophectoderm of the preimplantation blastocyst. The trophoblast of the fully functional (definitive) placenta promotes embryonic growth, viability and maternal health by mediating fetomaternal interactions. During early postimplantation development, part of the ExE forms the ectoplacental cone (EPC), which together with ExE make up the pre-placenta, the progenitor of the definitive placenta. The Ets2 gene encodes a member of the Ets family of nuclear transcription factors, whose expression is restricted to the ExE and EPC. Previous experiments with Ets2 null mouse conceptuses in vivo and in TS cells in vitro showed that Ets2 maintains ExE character and TS cell self-renewal. This project addressed several unexplored aspects of Ets2 involvement in trophoblast development. First, although Ets2 is expressed in the pre-placenta, its expression in the definitive placenta has not been investigated. This work shows for the first time that Ets2 expression is not restricted to pre-placental trophoblast, but it is also found in a dynamic fashion in definitive placental trophoblast, suggesting additional roles for this gene in trophoblast development and/or function. Second, previous TS cell work showed an Ets2 requirement for TS cell self-renewal, but whether Ets2 is also involved in TS cell differentiation requires further exploration. To this end, this project established the first lentivirus-based system for investigating gene function in TS cells via gene knockdown and used it to show that Ets2 in TS cells also promotes their differentiation into the EPC-derived trophoblast giant cells (TGCs) and junctional zone trophoblasts (JZTs). Third, although the in vivo pre-placental trophoblast phenotype of Ets2 knockout conceptuses, which die before mid-gestation, has been published, many aspects of this remain unexplored. For example, it is uncertain whether Ets2 is involved in EPC and TGC development or whether there are differences in non-ExE trophoblast between the two different phenotypes of these mutants (type-I and type-II phenotypes). This project re-examined these conceptuses and reveals that in both types, Ets2 promotes the formation of JZTs and secondary TGCs, but not that of primary TGCs. Evidence is provided that the mechanism for this novel Ets2 role is different between type-I and type-II mutants. Overall the findings of this study provide a new research tool for studying gene function in TS cells, new insights into the expression and function of Ets2 during preplacenta and placenta development and lastly, evidence showing that the early mouse preplacenta develops under hypoxia, similarly with the situation in humans.