MicroRNAs as modifiers of phenotype in glomerular disease and as potential regulators of gene transcription

Abstract

Η φαινοτυπική ετερογένεια σε σπειραματικές νεφρικές νόσους, δεν μπορεί να εξηγηθεί από μεταλλάξεις που εντοπίζονται σε γονίδια σχετικά με αυτές. Συνεπώς, είναι πιθανόν να εμπλέκονται τροποποιητικά γονίδια. Υποθέσαμε πως βλάβες στη ρύθμιση έκφρασης γονιδίων σχετικών με το σπείραμα από microRNAs, επηρεάζουν την κλινική εικόνα ασθενών με τέτοιες νόσους. Αφού πραγματοποιήθηκαν προβλέψεις στόχων για microRNAs στο 3’UTR και σε περιοχές πριν την έναρξη επιλεγμένων γονιδίων, στα οποία περιλαμβανόταν το γονίδιο HBEGF, ακολούθησε αλληλούχιση των περιοχών 3’UTR σε συγκεκριμένα γονίδια σε 162 ασθενείς με ήπια ή σοβαρή νεφροπάθεια. Ένας σημειακός πολυμορφισμός, ο C1936T (rs13385), βρέθηκε στο 3’UTR του HBEGF που αντιστοιχεί στην δεύτερη θέση της ακολουθίας δράσης του hsa-miR-1207-5p. Το HBEGF εκφράζεται στα ποδοκύτταρα και έχει αποδεδειγμένο ρόλο στην διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας του σπειράματος. Όταν AB8/13 μη-διαφοροποιημένα ποδοκύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμητές του συγκεκριμένου miRNA, τα επίπεδα της πρωτεΐνης HBEGF μειώθηκαν στο μισό. Ακολούθως, ένα κομμάτι DNA που περιλάμβανε το αλληλόμορφο C1936 κλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης και μαζί με μιμητές του miR-1207-5p μεταφέρθηκε σε AB8/13 ποδοκύτταρα, με αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασης της λουσιφεράσης, καταδεικνύοντας την ικανότητα του miR-1207-5p να ρυθμίζει απευθείας την μετάφραση του mRNA του HBEGF. Αντιθέτως, στην παρουσία του αλληλομόρφου T1936, η ρύθμιση αυτή καταργήθηκε. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν πως ο πολυμορφισμός Τ1936 παρεμποδίζει το miR-1207-5p να μειώνει ρυθμιστικά το HBEGF στα ποδοκύτταρα. Μετά την γονοτύπηση 78 ασθενών με σπειραματοπάθεια CFHR5, φάνηκε στατιστικά ενισχυμένη η παρουσία του T1936 αλληλόμορφου σε ασθενείς με νόσο σοβαρού τύπου. Άλλες ομάδες ασθενών που εμφανίζουν σπειραματοπάθεια, δεν έδειξαν παρόμοια συσχέτιση. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά στην οποία εμφανίζεται συσχέτιση και χαρακτηρισμός ενός πολυμορφισμού σχετικού με microRNA και μιας μονογονιδιακής νεφρικής νόσου. Η πρόβλεψη στόχων των miRNA που ενδεχομένως βρίσκονται σε ακολουθίες 10kb πριν τα σημεία έναρξη της μεταγραφής γονιδίων, έγινε με τον αλγόριθμο miRWalk και έδειξε πως συγκεκριμένα miRNAs παρουσίαζαν μεγάλου μήκους ακολουθίες στόχους σε τέτοιες περιοχές. Το hsa-miR-548c-5p προβλέφθηκε να στοχεύει μια ακολουθία 21 νουκλεοτιδίων σε μια περιοχή 8kb μακριά από την έναρξη του γονιδίου FOXC2. Υποθέσαμε πως το miRNA αυτό μπορεί να συνδέεται απευθείας στην DNA ακολουθία αυτή, έτσι χρησιμοποιήθηκε ένα πλασμιδιακό σύστημα αναφοράς λουσιφεράσης. Η ακολουθία στόχος κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο αυτό, ενώ δημιουργήθηκε και δεύτερο πλασμίδιο από το οποίο απουσίαζε η ακολουθία στόχος όμως διατηρήθηκαν οι εκατέρωθεν ακολουθίες. Μετά από επιμόλυνση των AB8/13 ποδοκύτταρων η λουσιφεράση είχε αυξημένα επίπεδα έκφρασης στην απουσία της ακολουθίας στόχου, καταδεικνύοντας έτσι την ρυθμιστική σημασία της. Επιπρόσθετα, τα ποδοκύτταρα AB8/13 επιμολύνθηκαν με μιμητές του miR-548c-5p και το πλασμίδιο λουσιφεράσης που έφερε την περιοχή στόχου, με αποτέλεσμα να μειωθούν τα επίπεδα έκφρασης της λουσιφεράσης. Επιμόλυνση με παρεμποδιστές του miR-548c-5p έδειξαν τα αντίθετα αποτελέσματα. Επιπρόσθετα έγινε εφαρμογή ενός τροποποιημένου πρωτοκόλλου ChIP, με το οποίο έγινε ταυτόχρονη απομόνωση τόσο του miRNA, όσο και της DNA περιοχής στόχου του σε διαλύματα όπου χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα που στοχεύει την πρωτεΐνη AGO. Έτσι επιτεύχθηκε η απομόνωση του ενδογενώς εκφραζόμενου miR-548c-5p από ποδοκύτταρα σε καλλιέργεια, μαζί με την αντίστοιχη DNA ακολουθία στόχο του. Συνολικά, αποδείχθηκε για πρώτη φορά η απευθείας σύνδεσης ενός miRNA σε μια ακολουθία DNA στόχο.

Phenotypic severity in glomerular diseases cannot be usually explained by mutations in relevant genes, thus suggesting the implication of modifier genes which drive the clinical picture towards a milder or a severe course of the disease. We hypothesized that faulty expressional regulation of genes associated with the glomerulus by microRNAs, can be influencing such phenotypic alterations. After performing microRNA 3’UTR and promoter region target prediction analyses using relevant genes, including the HBEGF gene, we proceeded in sequencing the 3’UTR regions in 162 patients having mild or severe nephropathy (TBMN). HBEGF is expressed in podocytes and was shown to play a role in glomerular physiology. A single nucleotide polymorphism, C1936T (rs13385), was identified at the 3’UTR of HBEGF that corresponds to the second base of the seed region of miR-1207-5p. When AB8/13 undifferentiated podocytes were transfected with miRNA mimics, HBEGF protein levels were reduced by 50%. A DNA fragment containing the SNP C1936 allele was cloned into the pMIR-Report Luciferase vector and co-transfected with miR-1207-5p mimics into AB8/13 podocytes. This resulted in reduced luciferase expression demonstrating the ability of miR-1207-5p to directly regulate HBEGF expression. On the contrary, in the presence of the T1936 allele, this regulation was abolished. Collectively, these results demonstrate that variant T1936 prevents miR-1207-5p from down-regulating HBEGF in podocytes. We hypothesized that this variant has a functional role as a genetic modifier. To this end, we showed that in 78 patients diagnosed with CFHR5 nephropathy, inheritance of the T1936 allele was significantly increased in the group demonstrating severe disease. No similar association was detected in other nephropathy cohorts. This is the first report associating a miRSNP as genetic modifier to a monogenic renal disorder. Prediction analysis of miRNA target sites on DNA regions located up to 10kb upstream of gene transcription start points using the miRWalk algorithm, revealed miRNAs that had extended target sites on such regions. The hsa-miR-548c-5p was predicted to target a 21nt long site located 8kb upstream FOXC2 gene. We hypothesized that this miRNA can target its predicted DNA sequence upstream FOXC2 and we used luciferase reporter constructs to prove this direct interaction. The miR-548c-5p DNA target site was cloned into these vectors, while a second plasmid was generated, which lacked the miRNA target site but preserved its flanking sequence. Transfection of AB8/13 podocytes with both plasmids showed a significant increase of luciferase expression levels when the miR-548c-5p site was removed, thus suggesting a repressive role for this sequence in transcription. To prove the direct binding of miR-548c-5p on its target sequence, AB8/13 podocytes were transfected with miR-548c-5p mimics and the plasmid bearing the miRNA target site, causing luciferase levels to be significantly reduced. Transfections with miRNA inhibitors boosted luciferase expression levels. To support further these results we developed a modified ChIP protocol and succeeded in isolating both the DNA region upstream FOXC2 and the miR-548c-5p, using an antibody against AGO proteins. Conclusively, this is the first attempt in showing directly that a specific miRNA may be active against DNA target sequences.