Show simple item record

dc.contributor.advisorDeltas, Constantinosen
dc.contributor.authorPapagregoriou, Gregorisen
dc.coverage.spatialΚύπροςel
dc.coverage.spatialCyprusen
dc.creatorPapagregoriou, Gregorisen
dc.date.accessioned2012-09-03T08:39:21Z
dc.date.accessioned2017-08-03T09:25:09Z
dc.date.available2012-09-03T08:39:21Z
dc.date.available2017-08-03T09:25:09Z
dc.date.copyright2012-05
dc.date.issued2012-05
dc.date.submitted2012-05-28
dc.identifier.urihttps://gnosis.library.ucy.ac.cy/handle/7/39119
dc.descriptionIncludes bibliographical references (p. 84-101).en
dc.descriptionNumber of sources in the bibliography: 117en
dc.descriptionThesis (Ph. D.) -- University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences, Department of Biological Sciences, May 2012.en
dc.descriptionThe University of Cyprus Library holds the printed form of the thesis.en
dc.description.abstractΗ φαινοτυπική ετερογένεια σε σπειραματικές νεφρικές νόσους, δεν μπορεί να εξηγηθεί από μεταλλάξεις που εντοπίζονται σε γονίδια σχετικά με αυτές. Συνεπώς, είναι πιθανόν να εμπλέκονται τροποποιητικά γονίδια. Υποθέσαμε πως βλάβες στη ρύθμιση έκφρασης γονιδίων σχετικών με το σπείραμα από microRNAs, επηρεάζουν την κλινική εικόνα ασθενών με τέτοιες νόσους. Αφού πραγματοποιήθηκαν προβλέψεις στόχων για microRNAs στο 3’UTR και σε περιοχές πριν την έναρξη επιλεγμένων γονιδίων, στα οποία περιλαμβανόταν το γονίδιο HBEGF, ακολούθησε αλληλούχιση των περιοχών 3’UTR σε συγκεκριμένα γονίδια σε 162 ασθενείς με ήπια ή σοβαρή νεφροπάθεια. Ένας σημειακός πολυμορφισμός, ο C1936T (rs13385), βρέθηκε στο 3’UTR του HBEGF που αντιστοιχεί στην δεύτερη θέση της ακολουθίας δράσης του hsa-miR-1207-5p. Το HBEGF εκφράζεται στα ποδοκύτταρα και έχει αποδεδειγμένο ρόλο στην διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας του σπειράματος. Όταν AB8/13 μη-διαφοροποιημένα ποδοκύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμητές του συγκεκριμένου miRNA, τα επίπεδα της πρωτεΐνης HBEGF μειώθηκαν στο μισό. Ακολούθως, ένα κομμάτι DNA που περιλάμβανε το αλληλόμορφο C1936 κλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης και μαζί με μιμητές του miR-1207-5p μεταφέρθηκε σε AB8/13 ποδοκύτταρα, με αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασης της λουσιφεράσης, καταδεικνύοντας την ικανότητα του miR-1207-5p να ρυθμίζει απευθείας την μετάφραση του mRNA του HBEGF. Αντιθέτως, στην παρουσία του αλληλομόρφου T1936, η ρύθμιση αυτή καταργήθηκε. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν πως ο πολυμορφισμός Τ1936 παρεμποδίζει το miR-1207-5p να μειώνει ρυθμιστικά το HBEGF στα ποδοκύτταρα. Μετά την γονοτύπηση 78 ασθενών με σπειραματοπάθεια CFHR5, φάνηκε στατιστικά ενισχυμένη η παρουσία του T1936 αλληλόμορφου σε ασθενείς με νόσο σοβαρού τύπου. Άλλες ομάδες ασθενών που εμφανίζουν σπειραματοπάθεια, δεν έδειξαν παρόμοια συσχέτιση. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά στην οποία εμφανίζεται συσχέτιση και χαρακτηρισμός ενός πολυμορφισμού σχετικού με microRNA και μιας μονογονιδιακής νεφρικής νόσου. Η πρόβλεψη στόχων των miRNA που ενδεχομένως βρίσκονται σε ακολουθίες 10kb πριν τα σημεία έναρξη της μεταγραφής γονιδίων, έγινε με τον αλγόριθμο miRWalk και έδειξε πως συγκεκριμένα miRNAs παρουσίαζαν μεγάλου μήκους ακολουθίες στόχους σε τέτοιες περιοχές. Το hsa-miR-548c-5p προβλέφθηκε να στοχεύει μια ακολουθία 21 νουκλεοτιδίων σε μια περιοχή 8kb μακριά από την έναρξη του γονιδίου FOXC2. Υποθέσαμε πως το miRNA αυτό μπορεί να συνδέεται απευθείας στην DNA ακολουθία αυτή, έτσι χρησιμοποιήθηκε ένα πλασμιδιακό σύστημα αναφοράς λουσιφεράσης. Η ακολουθία στόχος κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο αυτό, ενώ δημιουργήθηκε και δεύτερο πλασμίδιο από το οποίο απουσίαζε η ακολουθία στόχος όμως διατηρήθηκαν οι εκατέρωθεν ακολουθίες. Μετά από επιμόλυνση των AB8/13 ποδοκύτταρων η λουσιφεράση είχε αυξημένα επίπεδα έκφρασης στην απουσία της ακολουθίας στόχου, καταδεικνύοντας έτσι την ρυθμιστική σημασία της. Επιπρόσθετα, τα ποδοκύτταρα AB8/13 επιμολύνθηκαν με μιμητές του miR-548c-5p και το πλασμίδιο λουσιφεράσης που έφερε την περιοχή στόχου, με αποτέλεσμα να μειωθούν τα επίπεδα έκφρασης της λουσιφεράσης. Επιμόλυνση με παρεμποδιστές του miR-548c-5p έδειξαν τα αντίθετα αποτελέσματα. Επιπρόσθετα έγινε εφαρμογή ενός τροποποιημένου πρωτοκόλλου ChIP, με το οποίο έγινε ταυτόχρονη απομόνωση τόσο του miRNA, όσο και της DNA περιοχής στόχου του σε διαλύματα όπου χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα που στοχεύει την πρωτεΐνη AGO. Έτσι επιτεύχθηκε η απομόνωση του ενδογενώς εκφραζόμενου miR-548c-5p από ποδοκύτταρα σε καλλιέργεια, μαζί με την αντίστοιχη DNA ακολουθία στόχο του. Συνολικά, αποδείχθηκε για πρώτη φορά η απευθείας σύνδεσης ενός miRNA σε μια ακολουθία DNA στόχο.el
dc.description.abstractPhenotypic severity in glomerular diseases cannot be usually explained by mutations in relevant genes, thus suggesting the implication of modifier genes which drive the clinical picture towards a milder or a severe course of the disease. We hypothesized that faulty expressional regulation of genes associated with the glomerulus by microRNAs, can be influencing such phenotypic alterations. After performing microRNA 3’UTR and promoter region target prediction analyses using relevant genes, including the HBEGF gene, we proceeded in sequencing the 3’UTR regions in 162 patients having mild or severe nephropathy (TBMN). HBEGF is expressed in podocytes and was shown to play a role in glomerular physiology. A single nucleotide polymorphism, C1936T (rs13385), was identified at the 3’UTR of HBEGF that corresponds to the second base of the seed region of miR-1207-5p. When AB8/13 undifferentiated podocytes were transfected with miRNA mimics, HBEGF protein levels were reduced by 50%. A DNA fragment containing the SNP C1936 allele was cloned into the pMIR-Report Luciferase vector and co-transfected with miR-1207-5p mimics into AB8/13 podocytes. This resulted in reduced luciferase expression demonstrating the ability of miR-1207-5p to directly regulate HBEGF expression. On the contrary, in the presence of the T1936 allele, this regulation was abolished. Collectively, these results demonstrate that variant T1936 prevents miR-1207-5p from down-regulating HBEGF in podocytes. We hypothesized that this variant has a functional role as a genetic modifier. To this end, we showed that in 78 patients diagnosed with CFHR5 nephropathy, inheritance of the T1936 allele was significantly increased in the group demonstrating severe disease. No similar association was detected in other nephropathy cohorts. This is the first report associating a miRSNP as genetic modifier to a monogenic renal disorder. Prediction analysis of miRNA target sites on DNA regions located up to 10kb upstream of gene transcription start points using the miRWalk algorithm, revealed miRNAs that had extended target sites on such regions. The hsa-miR-548c-5p was predicted to target a 21nt long site located 8kb upstream FOXC2 gene. We hypothesized that this miRNA can target its predicted DNA sequence upstream FOXC2 and we used luciferase reporter constructs to prove this direct interaction. The miR-548c-5p DNA target site was cloned into these vectors, while a second plasmid was generated, which lacked the miRNA target site but preserved its flanking sequence. Transfection of AB8/13 podocytes with both plasmids showed a significant increase of luciferase expression levels when the miR-548c-5p site was removed, thus suggesting a repressive role for this sequence in transcription. To prove the direct binding of miR-548c-5p on its target sequence, AB8/13 podocytes were transfected with miR-548c-5p mimics and the plasmid bearing the miRNA target site, causing luciferase levels to be significantly reduced. Transfections with miRNA inhibitors boosted luciferase expression levels. To support further these results we developed a modified ChIP protocol and succeeded in isolating both the DNA region upstream FOXC2 and the miR-548c-5p, using an antibody against AGO proteins. Conclusively, this is the first attempt in showing directly that a specific miRNA may be active against DNA target sequences.en
dc.format.extentviii, 108 p. : col. ill., tables ; 30 cm.en
dc.language.isoengen
dc.publisherΠανεπιστήμιο Κύπρου, Σχολή Θετικών και Εφαρμοσμένων Επιστημών / University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessen
dc.rightsOpen Accessen
dc.subject.lcshRNAen
dc.subject.lcshSmall interfering RNAen
dc.subject.lcshEpidermal growth factoren
dc.subject.lcshKidney glomerulus Diseasesen
dc.subject.lcshKidneys Diseases Genetic aspectsen
dc.subject.lcshGenetic regulationen
dc.titleMicroRNAs as modifiers of phenotype in glomerular disease and as potential regulators of gene transcriptionen
dc.title.alternativeΤα microRNAs σαν τροποποιητικοί παράγοντες του φαινότυπου σπειραματικών νόσων και σαν ρυθμιστές της μεταγραφής γονιδίωνel
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.contributor.committeememberΔέλτας, Κωνσταντίνοςel
dc.contributor.committeememberΚυρμίζης, Αντώνηςel
dc.contributor.committeememberΓεωργιάδης, Παντελήςel
dc.contributor.committeememberΡαγούσης, Ιωάννηςel
dc.contributor.committeememberΧατζοπούλου-Κλαδαρά, Μαργαρίταel
dc.contributor.committeememberDeltas, Constantinosen
dc.contributor.committeememberKirmizis, Antonisen
dc.contributor.committeememberGeorgiades, Pantelisen
dc.contributor.committeememberRagousis, Ioannisen
dc.contributor.committeememberChatzopoulou-Kladara, Margaritaen
dc.contributor.departmentΠανεπιστήμιο Κύπρου, Σχολή Θετικών και Εφαρμοσμένων Επιστημών, Τμήμα Βιολογικών Επιστημώνel
dc.contributor.departmentUniversity of Cyprus, Faculty of Pure and Applied Sciences, Department of Biological Sciencesen
dc.subject.uncontrolledtermΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΠΑΘΕΙΑel
dc.subject.uncontrolledtermΓΕΝΕΤΙΚΗel
dc.subject.uncontrolledtermΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣel
dc.subject.uncontrolledtermΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣel
dc.subject.uncontrolledtermΠΡΩΤΕΪΝΟΥΡΙΑel
dc.subject.uncontrolledtermΑΙΜΑΤΟΥΡΙΑel
dc.subject.uncontrolledtermΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΓΟΝΙΔΙΟel
dc.subject.uncontrolledtermΜΗ-ΚΩΔΙΚΟ RNAel
dc.subject.uncontrolledtermMICRORNAen
dc.subject.uncontrolledtermHBEGFen
dc.subject.uncontrolledtermCFHR5 NEPHROPATHYen
dc.subject.uncontrolledtermMICRORNA TRANSCRIPTIONAL REGULATIONen
dc.subject.uncontrolledtermLUCIFERASE REPORTER ASSAYen
dc.subject.uncontrolledtermCHROMATIN IMMUNOPRECIPITATIONen
dc.subject.uncontrolledtermMIRSNPen
dc.subject.uncontrolledtermGENETIC ASSOCIATIONen
dc.identifier.lcQP623.5.S63P37 2012en
dc.author.facultyΣχολή Θετικών και Εφαρμοσμένων Επιστημών / Faculty of Pure and Applied Sciences
dc.author.departmentΤμήμα Βιολογικών Επιστημών / Department of Biological Sciences
dc.type.uhtypeDoctoral Thesis
dc.rights.embargodate2012-05-28


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record