Ανάπτυξη συνθετικών υδρόφιλων, κατιοντικών βιοϋλικών για χρήση σε τεχνολογίες μικρού παρεμβατικού RNA

Abstract

Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή παρουσιάζεται η ανάπτυξη κατιοντικών πολυμερικών συστημάτων για χρήση στην τεχνολογία του siRNA. Το πρώτο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής παρουσιάζει τη σύνθεση, το χαρακτηρισμό και την αξιολόγηση κατιοντικών γραμμικών και αστεροειδών ομοπολυμερών για μεταφορά siRNA σε κύτταρα θηλαστικών, ενώ το δεύτερο μέρος περιλαμβάνει τη σύνθεση, το χαρακτηρισμό και την αξιολόγηση αμφιφιλικών και αμφολυτικών πολυμερικών πλεγμάτων σαν συστήματα προσρόφησης RNA. Συνολικά, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μίας σειράς κατιοντικών γραμμικών ομοπολυμερών, τεσσάρων σειρών υδρόφιλων κατιοντικών αστεροειδών ομοπολυμερών βασισμένων σε νέους διασταυρωτές καθώς και δύο σειρών πολυμερικών πλεγμάτων διασυνδεδεμένων στα άκρα, μίας σειράς αμφολυτικών και μίας σειράς ημιφθοριωμένων αμφιφιλικών. Η σύνθεση των γραμμικών και αστεροειδών ομοπολυμερών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του ελεγχόμενου πολυμερισμού μεταφοράς ομάδας (GTP), ενώ η σύνθεση των πολυμερικών πλεγμάτων με τoν πολυμερισμό ριζών μεταφοράς αλυσίδας με αντιστρεπτή προσθήκη-απόσπαση (RAFT). Τα γραμμικά και τα αστεροειδή ομοπολυμερή χαρακτηρίστηκαν ως προς τα μοριακά βάρη (ΜΒ), τα απόλυτα ΜΒ, τους δείκτες πολυδιασποράς, τους αριθμούς βραχιόνων, τις υδροδυναμικές διαμέτρους, τις θερμοκρασίες νεφέλωσης και τις τιμές pK. Οι πρόδρομες αλυσίδες των πολυμερικών πλεγμάτων χαρακτηρίστηκαν ως προς τα ΜΒ και τη σύστασή τους, ενώ όλα τα πολυμερικά πλέγματα χαρακτηρίστηκαν ως προς το ποσοστό της μη-ενσωματωθείσας πολυμερικής μάζας και τους βαθμούς διόγκωσής τους σε τετραϋδροφουράνιο και σε καθαρό νερό και νερό με διάφορα pH (διάφορους βαθμούς ιονισμού). Τέλος, όλα τα αστεροειδή ομοπολυμερή αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να μεταφέρουν siRNA σε κύτταρα μυοβλαστών τα οποία εξέφραζαν σταθερά το γονίδιο της πρωτεΐνης αυξημένου πράσινου φθορισμού (ΕGFP). Περαιτέρω, όλα τα πλέγματα που συντέθηκαν χαρακτηρίστηκαν ως προς την ικανότητά τους να προσροφούν RNA σε βασικό, όξινο και ουδέτερο περιβάλλον.

This Ph. D. Thesis presents the development of cationic polymer systems for use in siRNA technology. The first part of the Thesis focuses on the synthesis, characterization and evaluation of cationic linear and star homopolymers for siRNA transfection, while the second part concerns the synthesis and characterization of amphiphilic and ampholytic polymer conetworks which adsorb RNA. In total, one series of cationic linear homopolymers and three series of novel cationic star homopolymers, based on novel cross-linkers as well as one series of end-linked ampholytic polymer conetworks and one series of end-linked semifluorinated amphiphilic polymer conetworks were developed. The synthesis of the linear and star homopolymers was accomplished using the controlled polymerization techinique group transfer polymerization (GTP), while the synthesis of the amphiphilic and ampholytic polymer conetworks was carried out by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization. The resulting linear and star homopolymers and their linear precursors were characterized in terms of their molecular weights (MWs), polydispersity indices, absolute MWs, number of arms, hydrodynamic diameters, cloud points and effective pKs. All the conetwork precursors were characterized in terms of their MWs and compositions, while all the conetworks were characterized in terms of their extractables and degrees of swelling (DS) in THF, pure water and in water as a function of the pH. Finally, all star homopolymers were evaluated for their ability to deliver siRNA to the C2C12 mouse myoblast cell line, expressing the reporter enhanced green fluorescent protein (EGFP), while all the conetworks were characterized for their ability to adsorb RNA in neutral, acidic and basic environment.