Investigating the function of long intergenic non-coding RNAs in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Το γονιδίωμα διαφόρων ευκαρυωτικών οργανισμών μεταφράζεται σχεδόν σε όλο το μήκος τους και αυτό το φαινόμενο ονομάζεται διάτρητη μεταγραφή. Μέσω της διάτρητης μεταγραφής παράγεται ένα τεράστιος αριθμός μακριών μη-κωδικών ριβονουκλεοτιδίων (long non-coding RNAs – lncRNAs). Επειδή γνωρίζουμε τον βιολογικό ρόλο μόνο μερικών lncRNAs, είναι αβέβαιο αν όλα έχουν βιολογική σημασία. Επομένως σε αυτή την μελέτη αναλύσαμε τον ρόλο των lncRNAs βασιζόμενοι στις γενετικές τους αλληλεπιδράσεις με γονίδια που εκφράζουν πρωτεΐνες. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική SGA (Synthetic Genetic Array) για να αναγνωρίσουμε όλες τις γενετικές αντιδράσεις στον ευκαρυοτικό μικροοργανισμό Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae). Για να βελτιστοποιήσουμε την τεχνική SGA, χρησιμοποιήσαμε το lncRNA TLC1 το οποίο λειτουργεί ως εκμαγείο για την σύνθεση τελομερών από το ένζυμο τελομεράση. Μετά χρησιμοποιήσαμε την τεχνική SGA για να αναγνωρίσουμε τις γενετικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων και έξι ενδογονιδιακών lncRNAs (long intergenic non-coding RNAs - lincRNAs) για τα οποία δεν γνωρίζαμε τον βιολογικό τους ρόλο. Βασιζόμενοι στις γενετικές τους αντιδράσεις με γονίδια καταφέραμε να προσδιορίσουμε τις βιολογικές διαδικασίες στις οποίες αυτά τα έξι lincRNAs ενδεχομένως να εμπλέκονται. Μέτα επικεντρώσαμε την έρευνα στην εκτενέστερη ανάλυση του βιολογικού ρόλου ενός από τα έξι lincRNAs, το οποίο ονομάζεται SUT457. Ανακαλύψαμε ότι το lincRNA SUT457 εμπλέκεται στην οργάνωση των τελομερών. Συνδυασμός της διαγραφής του SUT457 και του TLC1 οδηγεί σε γρηγορότερη γήρανση των κυττάρων που είναι ενδεικτικό του ότι η διαδικασία της ρύθμισης του μονόκλωνου DNA των τελομερών δεν λειτουργεί φυσιολογικά. Ακολούθως, αποδείξαμε ότι η απουσία του SUT457 οδηγεί σε μακρύτερο μονόκλωνο DNA στα τελομερή μέσω μιας διαδικασίας που εξαρτάται από την εξωνουκλεάση Exo1. Επίσης αποδείξαμε ότι το SUT457 ρυθμίσει το μονόκλωνο DNA των τελομερών δουλεύοντας μακριά από το σημείο έκφρασης του (trans-acting). Συλλογικά αποδείξαμε ότι μπορούμε να βρούμε τον βιολογικό ρόλο των lincRNAs βασιζόμενοι στις γενετικές τους αλληλεπιδράσεις και προτείνουμε ότι αυτή η προσέγγιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον χαρακτηρισμό lincRNAs στον άνθρωπο.

Eukaryotic genomes are pervasively transcribed, producing a vast number of long non-coding RNAs (lncRNAs). Only a few of them have been functionally characterized so far, thus their biological significance is yet under debate. Even less lncRNAs have been annotated as essential hence implying that the majority of them may be functionally redundant. Therefore, we hypothesized that the function of lncRNAs could be revealed by systematic construction of double mutant yeast strains, each one bearing a lncRNA deletion in combination with protein-coding gene deletions. To address this hypothesis, we utilized Synthetic Genetic Array (SGA) for long intergenic non-coding RNAs (lincRNAs) in Saccharomyces cerevisiae in order to identify their genetic interactions (GIs) with protein-coding genes. We validated this approach by demonstrating that the known biological role of a well described lincRNA called TLC1 (TeLomerase Component 1) can be inferred through its GI network. We subsequently performed SGA screens on a set of uncharacterized lincRNAs and uncovered their connection to diverse cellular processes. We focused on one of the tested lincRNAs, SUT457, which showed genetic interactions with genes involved in telomere organization. Deeper investigation showed that loss of SUT457 induces premature senescence in telomerase-deficient cells and resulted in telomeric overhang accumulation compared to wild type (WT) yeast cells. We discovered that the telomeric overhang accumulation intensified after subculturing of sut457Δ cells in an Exo1-dependent manner. Furthermore, the GI profile of SUT457 was distinct from that of its neighboring genes suggesting that SUT457 may function independently to its genomic location. This was supported by the fact that ectopic expression of SUT457 exhibited WT telomeric overhang phenotype, revealing that SUT457 is working in trans. Overall, this study demonstrated that; a) Genetic interaction profiling can be used for functional characterization of a plethora, if not for all lncRNAs in yeast and possibly can be implemented in other complex organisms, b) SGA screens implicate lincRNAs in various cellular procedures, in addition to their well-described role in gene transcription and c) SUT457 is a novel trans-acting telomere organization lincRNA involved in telomeric overhang homeostasis by an Exo1-dependent manner. In conclusion, by characterizing the biological role of lincRNAs in the eukaryotic model organism Saccharomyses cerevisiae we added evidence on the growing perception that long ncRNAs are functionally significant molecules which add complexity to the biological systems by affecting a variety of cellular processes.