The potential role of miR-548c-5p in regulating FOXC2 transcription in differentiating human podocytes

Abstract

Τα ποδοκύτταρα είναι διαφοροποιημένα επιθηλιακά σπειραματικά κύτταρα και αποτελούν μέρος του φραγμού σπειραματικής διήθησης στο σπείραμα κάθε νεφρώνα. Ο πρώτος μοριακός δείκτης που εμφανίζεται στα ποδοκύτταρα είναι ο μεταγραφικός παράγοντας FOXC2 και είναι απαραίτητος για την έναρξη της διαφοροποίησης, αλλά και της ανάπτυξης και ωρίμανσης των ποδοκυττάρων. Τα microRNAs είναι μια εξελικτικά διατηρημένη κλάση μικρών μορίων μη μεταφραζόμενου RNA με σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων. ‘Έχει αποδειχτεί η αναγκαιότητά τους στη λειτουργία των ποδοκυττάρων, αφού όταν αφαιρεθεί το γονίδιο της ενδονουκλεάσης περιορισμού Dicer σε ποδοκύτταρα ποντικών, αυτά δεν μπορούν να διατηρήσουν τη δράση τους στο φραγμό σπειραματικής διήθησης. Προβλέψεις για ακολουθίες που ενδεχομένως στοχεύουν microRNAs σε περιοχές που θεωρούνται ως προαγωγείς ή ρυθμιστικές περιοχές μεταγραφής γονιδίων (10 χιλιάδες βάσεις πριν την αρχή του 5’UTR άκρου τους), αποκάλυψαν μια ακολουθία-στόχο με πλήρη συμπληρωματικότητα ως προς το miR-548c-5p. Η ακολουθία βρίσκεται σε μια γονιδιακή περιοχή που απέχει περισσότερο από 8kb από το γονίδιο FOXC2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το ότι τόσο το miR-548c-5p όσο και η συγκεκριμένη ακολουθία στόχος απουσιάζουν από άλλους μη πρωτεύοντες οργανισμούς. Υποθέσαμε ότι η μεταγραφή του FOXC2 κατά τη διαφοροποίηση των ποδοκυττάρων ρυθμίζεται από το miR-548c-5p μέσω αυτής της ακολουθίας-στόχου. Σε πειράματα που έγιναν σε κυτταρική σειρά ανθρωπίνων ποδοκυττάρων με πλασμίδια ελέγχου έκφρασης λουσιφεράσης στα οποία κλωνοποιήθηκε μέσα στον ενισχυτή του πλασμιδίου η ακολουθία-στόχος, επιβεβαιώθηκε η στόχευσή της από το miR-548c-5p, με μόρια μιμητές του miRNA να μειώνουν, ενώ αναστολείς-παρεμποδιστές του να ενισχύουν την έκφραση της λουσιφεράσης. Με την εισαγωγή μεταλλάξεων σε νουκλεοτίδια της ακολουθίας στόχου που αντιστοιχούν στο seed region του miR-548c-5p, βρέθηκε πως οι επιδράσεις παύουν να υφίστανται. Επιπλέον, σε καλλιέργειες ποδοκυττάρων, τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης FOXC2 ανταποκρίνονται στα επίπεδα του miR-548c-5p συγχρονισμένα πριν και μετά την επαγωγή της διαφοροποίησης με υψηλή στατιστική σημαντικότητα. Πειράματα ανοσοκαθίζησης χρωματίνης (ChIP) με τη χρήση αντισώματος που στοχεύει όλα τα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Argonaute (AGO), αποκάλυψαν την κατάληψη της DNA ακολουθίας-στόχου από το RISC σε αδιαφοροποίητα ποδοκύτταρα και την απελευθέρωσή του με την επαγωγή της διαφοροποίησης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η γενωμική περιοχή που περιλαμβάνει την ακολουθία-στόχο να αλληλεπιδρά με την περιοχή του υποκινητή του FOXC2 και να οδηγεί σε ενίσχυση της έκφρασης του γονιδίου, όπως φαίνεται από πειράματα 3C. Συνεπώς, η γενωμική περιοχή που περιλαμβάνει την ακολουθία-στόχο είναι πιθανόν να έχει ρόλο ενισχυτή. Επιπλέον, το μοτίβο έκφρασης του FOXC2 κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των ποδοκυττάρων φαίνεται να επηρεάζεται από το miR-548c-5p. Πιο συγκεκριμένα, σε πειράματα αποτύπωσης κατά Western και ανοσοφθορισμού, όταν τα ποδοκύτταρα αφεθούν να ανακάμψουν από την επίδραση πολλαπλών συνεχόμενων διαμολύνσεων με μιμητές του miR-548c-5p, ανακτώνται τα επίπεδα των πρωτεϊνών και κατά προέκταση η πορεία της διαφοροποίησης, όπως φαίνεται και από την πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης FOXC2. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα αποτελέσματα συνολικά, προτείνεται ένας μηχανισμός δράσης μέσω του οποίου το σύμπλεγμα RISC/miR-548c-5p επηρεάζει την έκφραση του FOXC2 και κατά προέκταση τη διαφοροποίηση των ποδοκυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, καταδεικνύουν ένα καλά οργανωμένο μοντέλο ρύθμισης της έκφρασης του FOXC2 μέσω μιας απομακρυσμένης ακολουθίας-στόχου για το miR-548c-5p.

Podocytes are highly differentiated epithelial cells outlining glomerular vessels. FOXC2 is a transcription factor essential for inducing podocyte differentiation, development and maturation, and is considered to be the earliest podocyte marker. It has been found that microRNAs, a class of short non-coding single-stranded RNA molecules with a prominent role in the regulation of gene expression, are essential for podocyte function, as podocyte specific dicer knockouts fail to maintain glomerular function. miRNA prediction analysis revealed a full-length target site for the primate-specific miR-548c-5p at a genomic region >8kb upstream of FOXC2. Interestingly, both miR-548c-5p and this specific target site are absent from non-primates. It was hypothesised that the transcription rates of FOXC2 during podocyte differentiation might be tuned by miR-548c-5p through this target site. Experiments were performed with cultured human podocytes, transfected with luciferase reporter constructs bearing this target site region within an enhancer element of the native plasmid. The results confirmed a seed-region driven targeting potential by the miRNA, with mimics downregulating and inhibitors enhancing luciferase activity. Introducing mutations into the miRNA target seed region abolished the expected response. Moreover, also in cultured podocytes, FOXC2 mRNA and protein levels responded to miR-548c-5p abundance in a very coordinated manner before and after induction of differentiation, with high statistical significance. Ago-ChIP experiments using a Pan-Ago antibody revealed occupancy of the miRNA target site by miRNA/RISC in undifferentiated cells and its release when differentiation is initiated. The target site is thus allowed to interact with the gene’s promoter region leading to amplification of FOXC2 expression, as shown by chromosome conformation capture and qRT-PCR. Results are suggestive of an enhancing role for the region bearing the miRNA target site. Moreover, the expression pattern of FOXC2 during podocyte differentiation seems to be affected by miR-548c-5p, as removal of miR-548c-5p results in increased FOXC2 protein levels and cells resembling those undergoing differentiation. More specifically, in Western blot and immunofluorescence experiments, allowing hPCs to recover from the effect of several sequential miRNA mimic transfections, resulted in a rescue in protein levels and resumption of differentiation by examining the nuclear or cytoplasmic localization of FOXC2. Taking everything into account, a mechanism is proposed by which the RISC/miR-548c-5p complex influences the expression of FOXC2 and consequently affects podocyte differentiation. Collectively, results indicate a well-orchestrated regulatory model of FOXC2 expression by a remote upstream target site for miR-548c-5p.