Drosophila intestinal homeostasis and tumor growth is sustained by the tissue-intrinsic Eiger/TNF cytokine and through the active remodeling of the adult tracheal network

Abstract

Η χρόνια φλεγμονή έχει αναγνωριστεί ως σημαντικός παράγοντας κινδύνου για τον καρκίνο του γαστρεντερικού σωλήνα. Παρόλα αυτά οι κυτταρικές διεργασίες και οι οδοί σηματοδότησης που ενεργοποιούνται μέσω της χρόνιας φλεγμονής και οδηγούν στον μετασχηματισμό των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα πρέπει να μελετηθούν περαιτέρω. Οι αντιδράσεις φλεγμονής, όπως οι ενεργές ρίζες οξυγόνου, οι παθογόνες λοιμώξεις, η απορρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης, και η παραγωγή προ-φλεγμονωδών κυτοκινών μπορούν να οδηγήσουν σε καρκινογένεση. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιούμε ένα καθιερωμένο μοντέλο βακτηριακής εντερικής παθογένειας στη Drosophila melanogaster, όπου ένα παθογόνο βακτηριακό στέλεχος Pseudomonas aeruginosa οδηγεί σε εντερική βλάβη και αναγέννηση που προκαλείται από την ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού των εντερικών βλαστικών κυττάρων, με σκοπό να χαρακτηρίσουμε τις σηματοδοτικές οδούς και τους μοριακούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αναγέννηση του ιστού. Μελετώντας το ρόλο της αναγεννητικής σηματοδότησης των βλαστικών κυττάρων που βρίσκονται σε φάση μίτωσης σε συνθήκες φλεγμονής στο ενήλικο έντερο της D. melanogaster τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε μολυσματικές συνθήκες και ποσοτικοποιώντας τα μεταγραφικά επίπεδα διαφόρων γονιδίων διαπιστώσαμε ότι η μίτωση των βλαστικών κυττάρων συνδέεται θετικά με την έκφραση των γονιδίων eiger, Delta, upd3 και vein στο μεσέντερο, καθώς και με τη δυσπλασία και την άμυνα του ξενιστή, και αρνητικά με τον ενδο-πολλαπλασιασμό του γενετικού υλικού των εντεροκυττάρων. Παρέχουμε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο αλληλένδετος συνδυασμός των δύο μηχανισμών (μίτωσης και ενδο-πολλαπλασιασμού του γενετικού υλικού) ρυθμίζει την ομοιόσταση του μεσεντέρου, σύμφωνα με την οποία η μίτωση των βλαστικών κυττάρων μέσω της κυκλίνης Ε στα βλαστοκύτταρα προάγει τη βέλτιστη γραμμή άμυνας του ξενιστή σε συνθήκες φλεγμονής, εκτός και αν προκύψει δυσπλασία. Ωστόσο, η κυκλίνη Ε στους εντεροβλάστες προάγει τον ενδο-πολλαπλασιασμό του γενετικού υλικού των εντεροκυττάρων και αντισταθμίζει τη διαδικασία της μίτωσης των βλαστικών κυττάρων και την εμφάνιση δυσπλασίας, παρέχοντας έναν εναλλακτικό αλλά λιγότερο αποτελεσματικό μηχανισμό άμυνας για τον ξενιστή. Επιπλέον, δείξαμε ότι η κυτοκίνη Eiger/TNF, ανεξάρτητα από το συστημικό της ρόλο, δρα ως ένας διπλός ενδογενής ρυθμιστής της εντερικής μίτωσης της D. melanogaster. Ενώ η κυτοκίνη αυτή είναι παρούσα και επαγώγιμη στο λιπώδη ιστό, παρουσιάζει φυσιολογική έκφραση στα πρόδρομα κύτταρα και στα ώριμα εντεροκύτταρα ενώ δεν είναι επαγώγιμη μετά από εντερική βακτηριδιακή μόλυνση και ταυτόχρονη παρουσία αναγεννητικής σηματοδότησης στον ιστό. Στα πρόδρομα κύτταρα του μεσεντέρου η κυτοκίνη Eiger επιταχύνει την αναγέννηση του ιστού μέσω της δράσης των Wengen-JNK-Upd. Στα ώριμα εντεροκύτταρα, η κυτοκίνη Eiger σηματοδοτεί τον σπλαχνικό μυ μέσω των Grindelwald/Wengen-JNK για να εμποδίσει την έκφραση του wingless, ενός εξειδικευμένου αναπτυξιακού παράγοντα που διατηρεί τη μίτωση των βλαστικών κυττάρων. Αναγνωρίζουμε ζώνες υψηλής και χαμηλής έκφρασης Eiger στο μεσέντερο με ξεχωριστή έκφραση μεταξύ των πρόδρομων και ώριμων κυττάρων. Επιδεικνύουμε ότι ανάλογα με την ένταση του σήματος Eiger/TNF στα πρόδρομα έναντι στα ώριμα εντεροκύτταρα εξηγούνται και οι διαφορές στην αναγεννητική ικανότητα των γενετικά διαφορετικών στελεχών D. melanogaster και κατά μήκος του μεσεντέρου κάθε στελέχους. Σε μία δεύτερη γραμμή έρευνας διαπιστώσαμε ότι μετά την παθογόνο μόλυνση με το βακτήριο Ρ. aeruginosa, η τραχεία που οξυγονώνει το έντερο αναδιαμορφώνεται δραματικά (νέο-τραχειογένεση), παρόμοια με την παθολογική νέο-αγγειογένεση που παρατηρείται στα θηλαστικά, και αυτή η αναδιαμόρφωση είναι απαραίτητη για την αναγέννηση που προκαλείται από τα εντερικά βλαστικά κύτταρα μετά τη μόλυνση. Για να ταυτοποιηθούν τα μόρια που εμπλέκονται στη νεοτραχειογένεση, αξιολογήσαμε τη συντηρημένη οδό σηματοδότησης Hypoxia Inducible Factor 1α (Hif-1α)/Similar (Sima), η οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε συνθήκες φλεγμονής, αγγειογένεσης και όγκου. Βρήκαμε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Hif-1α/Sima και οι στόχοι του, FGF/Branchless (Bnl) και FGFR/Breathless (Btl), επάγονται στο έντερο που έχει υποστεί βλάβη και είναι απαραίτητοι για την αναγέννηση του ιστού που μεσολαβείται από τα εντερικά βλαστικά κύτταρα. Για να ελέγξουμε κατά πόσον γνωστοί ρυθμιστές του Hif-1α/Sima, όπως οι ενεργές ρίζες οξυγόνου (ROS) και η υποξία μπορούν να ενεργοποιήσουν την αναγέννηση του ιστού, την ενεργοποίηση του Hif-1α/Sima και τη δημιουργία νέων αγγείων στο ενήλικο έντερο, εκθέσαμε μύγες σε σίτιση με ROS, που προκαλούν φλεγμονή και αναγέννηση του ιστού, και μύγες σε συνθήκες υποξίας. Επιπλέον, τροφοδοτήσαμε μύγες με Sulfate Sodium Dextran (DSS), που επάγει την αναγέννηση του ιστού μέσω της διατάραξης της βασικής μεμβράνης. Βρήκαμε ότι τα ROS και το DSS προκαλούν αναγέννηση του εντέρου μέσω του πολλαπλασιασμού των βλαστικών κυττάρων. Εντούτοις, μόνο οι μύγες που τράφηκαν με ROS επέδειξαν δημιουργία νέων αγγείων (επαγωγή δραστηριότητας Hif-1α/Sima και έκφραση των FGF/bnl και FGFR/btl). Επίσης, διαπιστώσαμε ότι η υποξία, αν και αποτελεί ισχυρό επαγωγέα του Hif-1α/Sima και της τραχειογένεσης στο έντερο της D. melanogaster, αναστέλλει την αναγέννηση του ιστού που μεσολαβείται από τον πολλαπλασιασμό των εντερικών βλαστικών κυττάρων. Έτσι, τα πειράματά μας δείχνουν ότι η παθογόνος μόλυνση με P. aeruginosa προσομοιάζει τον φαινότυπο που προκύπτει μέσω των ROS και της υποξίας σε σχέση με την εντερική νέο-τραχειογένεση και ανεξάρτητα με την αναγεννητική ικανότητα του εντερικού επιθηλίου. Παρ' όλα αυτά, αν και η υποξία επάγει την τραχειογένεση, καταστέλλει την προκαλούμενη από P. aeruginosa αναγεννητική ανταπόκριση του ιστού που επιτυγχάνεται μέσω των εντερικών βλαστικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι το οξυγόνο (ή ένα προϊόν οξυγόνου) από την τραχεία είναι απαραίτητο για τη λειτουργία των εντερικών βλαστικών κυττάρων. Επιδεικνύουμε ότι η παραγωγή ROS από την εντερική τραχεία και το βακτήριο P. aeruginosa παρουσία οξυγόνου (νορμοξία) διευκολύνει την αναγεννητική απόκριση του ιστού μέσω των εντερικών βλαστικών κυττάρων. Εντυπωσιακά, η εξάλειψη των ROS που προέρχονται από την τραχεία μειώνει τον πολλαπλασιασμό των εντερικών βλαστικών κυττάρων που προκαλείται λόγω της λοίμωξης. Έτσι, οι ενεργές ρίζες οξυγόνου που προέρχονται από την τραχεία είναι απαραίτητες για την ανταπόκριση του ιστού στη φλεγμονή μέσω των εντερικών βλαστικών κυττάρων. Συνολικά η εργασία μας επικεντρώνεται στο ρόλο των συντηρημένων μονοπατιών σηματοδότησης TNFα, FGFR και Hif-1α στην εντερική ομοιόσταση και αναγέννηση, όχι μεμονωμένα, αλλά στο πλαίσιο του ευρύτερου περιβάλλοντος του εντέρου και των ιστών που το περιβάλλουν. Καθιερώνει για πρώτη φορά τη D. melanogaster ως πρότυπο μοντέλο για τη μελέτη της παθολογικής αγγειογένεσης στο εντερικό επιθήλιο του ενήλικου ζώου. Η ανακάλυψη των κυτταρικών γεγονότων και των σηματοδοτικών οδών που συνδέουν τη φλεγμονή με την αναγέννηση των ιστών και την τραχειογένεση στη D. melanogaster μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.

Chronic inflammation has been identified as an important risk factor for gastrointestinal cancer. Nevertheless, the cellular events and the signaling pathways triggered by chronic inflammation that drive the transformation of normal epithelial cells to cancerous cells require further study. Inflammatory responses, such as reactive oxygen species, pathogenic infections, immune response deregulation, and pro-inflammatory cytokine production might lead to carcinogenesis. In this study we use our established model of bacterial intestinal pathogenesis in Drosophila melanogaster, whereby a pathogenic bacterial strain of Pseudomonas aeruginosa induces intestinal injury and regeneration mediated by the activation of intestinal stem cell (ISC) proliferation, in order to characterize the signaling pathways and the molecular mechanisms that regulate tissue regeneration. By studying the role of tissue-intrinsic regenerative inflammatory signaling in stem cell mitosis of the adult D. melanogaster midgut at the baseline and the infected state through a quantitative genetic screen we found that stem cell mitosis is positively linked with the expression of eiger, Delta, upd3 and vein in the midgut, as well as with dysplasia and host defense, but negatively with enterocyte endoreplication. We provide evidence that intertwined trade-offs fine-tune midgut homeostasis, according to which stem cell mitosis through cyclin E in stem cells promotes the optimal host defense to infection, unless dysplasia ensues. However, cyclin E in enteroblasts promotes enterocyte endoreplication and counterbalances stem cell mitosis and dysplasia, providing an alternative but less efficient mechanism to support host defense. Moreover, we showed that the cytokine Eiger/TNF - independently of its systemic role - acts as a dual tissue-intrinsic switch of the D. melanogaster intestinal mitosis. While abundant and inducible in the fat body, Eiger has a basal expression in the midgut progenitors and mature enterocytes that is not inducible by intestinal infection and concomitant regenerative signaling. In the midgut progenitor cells, Eiger accelerates regeneration stem cell intrinsically, via the Wengen-JNK-Upd module. In the mature enterocytes Eiger signals the visceral muscle via the Grindelwald/Wengen-JNK module to inhibit the expression of wingless, a niche growth factor that sustains stem cell mitosis. We identify zones of high and low Eiger expression in the midgut with distinct progenitor and enterocyte expression. We demonstrate that the intensity of Eiger/TNF signal in progenitors vs. enterocytes explains differences in regeneration potential among genetically different individuals, and along the midgut of each individual. In a second line of research, we found that upon pathogenic P. aeruginosa infection, the trachea that oxygenates the intestine is dramatically remodeled (neotracheogenesis), similar to pathological neoangiogenesis observed in mammals, and this remodeling is necessary for ISC-mediated regeneration upon infection. To identify molecules involved in neotracheogenesis, we assessed the conserved Hypoxia Inducible Factor 1α (Hif-1α)/Similar (Sima) signaling, which is known to be involved in inflammation, angiogenesis and tumors. We found that Hif-1α/Sima and its targets, the FGF/Branchless (Bnl) and the FGFR/Breathless (Btl), are induced in the damaged intestine and are necessary for ISC-mediated regeneration. To test if known upstream regulators of Hif-1α/Sima, such as Reactive Oxygen Species (ROS) or hypoxia can trigger regeneration, Hif-1α/Sima activation and neotracheogenesis in the adult intestine, we orally exposed flies to exogenous ROS, which induce inflammatory signaling and regeneration and we reared flies in hypoxia. In addition, we fed flies with Dextran Sulfate Sodium (DSS), which induces regeneration by disrupting the basement membrane. We found that ROS and DSS caused an ISC-mediated regenerative response in the intestine. However, only ROS-treated flies exhibited induction of intestinal neotracheogenesis (induction of Hif-1α/Sima activity and expression of the FGF/bnl and the FGFR/btl). Interestingly, we found that hypoxia is a potent inducer of Hif-1α/Sima and tracheogenesis in the D. melanogaster intestine, although it inhibits ISC mediated regeneration. Thus, our experiments show that, pathogenic P. aeruginosa infection is phenocopied by ROS and hypoxia with regards to intestinal tracheogenesis, and this response is independent of regeneration. Nevertheless, although hypoxia induces tracheogenesis, it suppresses the P. aeruginosa-induced ISC regenerative response indicating that oxygen (or a product of oxygen) from the trachea is necessary for ISC function. We demonstrate that ROS generation from the intestinal trachea and P. aeruginosa in the presence of oxygen (normoxia) facilitates the ISC-mediated regenerative response. Strikingly, elimination of trachea-derived ROS diminishes the infection induced ISC proliferation. Thus, trachea derived ROS are necessary for ISC mediated regenerative response to infection. Overall, our work focused on the role of conserved signaling pathways: TNFα, FGFR, Hif-1α in intestinal homeostasis and regeneration, not in isolation but in the context of the wider environment of the intestine and the tissues that surround it. It establishes for the first time D. melanogaster as a model for the study of pathological angiogenesis in the intestinal epithelium of the adult animal. The discovery of the cellular events and the signaling pathways that link the inflammation, with tissue regeneration and tracheogenesis in D. melanogaster, may lead to the discovery of new therapeutic approaches.