Uncovering unknown aspects of the mouse placental bed and associated uterine structures during pregnancy, as well as of trophoblast stem cells, an in vitro model of placental development

Abstract

Αυτή η διατριβή χρησιμοποίησε το μοντέλο του ποντικού για να διερευνήσει ασαφείς, υπο-εξερεύνητες και κλινικά σημαντικές διεργασίες και δομές κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης in vivo καθώς και άγνωστες πτυχές σχετικά με τη βιολογία των τροφοβλαστικών βλαστοκυττάρων (κύτταρα TS) in vitro. Οι in vivo έρευνές μας επικεντρώθηκαν σε αλλαγές που προκαλούνται από εγκυμοσύνη σε συγκεκριμένες περιοχές της ενήλικης μήτρας, μια σωληνοειδή δομή στην οποία εμφυτεύονται τα κυήματα (στα ποντίκια υπάρχουν δύο τέτοιες δομές γνωστές ως κέρατα της μήτρας). Οι περιοχές της μήτρας που ερευνήθηκαν εδώ ήταν η πλακουντιακή περιοχή (placenta bed) και δύο σχετικές μητρικές δομές, το εσωτερικό μυομήτριο και το μεσομητριακό τρίγωνο. Η πλακουντιακή περιοχή (placenta bed) είναι εκείνο το τμήμα της μήτρας εντός του οποίου μεγαλώνει ο πλακούντας και εισβάλλουν τροφοβλαστικά κύτταρα προερχόμενα από τον πλακούντα (εισβαλλόμενοι τροφοβλάστες). Στα ποντίκια αυτή η περιοχή: (α) εφάπτεται του πλακούντα και βρίσκεται στο μεσομητριακό μισό της μήτρας, δηλαδή στην πλευρά της μήτρας πιο κοντά στον μεσομητριακό πόλο της (σημείο όπου η μήτρα συνδέεται με το μεσομήτριο, έναν επίπεδο ιστό μέσω του οποίου τα μητρικά αιμοφόρα αγγεία φτάνουν στη μήτρα και τον πλακούντα για να τα τροφοδοτήσουν και να τα αποστραγγίσουν) και (β) πιστεύεται ότι περιλαμβάνει μόνο την περιοχή του ενδομητρίου (εσωτερικό στρώμα της μήτρας) που βρίσκεται στο μεσομητριακό μισό της μήτρας, το οποίο κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης τροποποιείται και ονομάζεται φθαρτός υμένας (decidua basalis) ή μεσομητριακός υμένας (mesometrial decidua). Το ενδομητριακό μισό που βρίσκεται πιο κοντά στον αντιμεσομητριακό πόλο της μήτρας (αυτός που είναι απέναντι από τον μεσομητριακό πόλο) είναι το αντιμεσομητριακό ενδομήτριο και κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης επίσης τροποποιείται και λέγεται αντιμεσομητριακός υμένας (antimesometrial decidua). Το εσωτερικό μυομήτριο είναι το εσώτερο μυϊκό στρώμα της μήτρας, περιβάλλει όλη την περιφέρεια της και το εσωτερικό του όριο και εφάπτεται στο εξωτερικό όριο του φθαρτoύ (decidua). Το μεσομητριακό τρίγωνο είναι ένας ιστός που βρίσκεται εκεί όπου το μεσομήτριο προσκολλάται στη μήτρα, έχει σχήμα τριγώνου σε τομές και αποτελεί το σημείο εισόδου των μητρικών αιμοφόρων αγγείων στη μήτρα. Στο μεσομητριακό μισό της μήτρας, η «βάση» του μεσομητριακού τριγώνου συνορεύει με την εξωτερική επιφάνεια του εσωτερικού μυομητρίου. Η in vitro εργασία μας αφορούσε τα κύτταρα TS, έναν από τους τρεις θεμελιώδεις τύπους βλαστοκυττάρων που προέρχονται από το πρώιμο έμβρυο. Τα κύτταρα TS, όπως και τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (κύτταρα ES) έχουν απεριόριστη αυτοανανέωση, καθώς μπορούν να διατηρηθούν αδιαφοροποίητα και να πολλαπλασιάζονται υπό συγκεκριμένες συνθήκες καλλιέργειας μετά από πολύ μεγάλο αριθμό καλλιεργείων (passages). Σε αντίθεση με τα ES κύτταρα που μπορούν να διαφοροποιηθούν σε όλους τους κυτταρικούς τύπους εμβρύου/νεογέννητου, τα κύτταρα TS μπορούν να διαφοροποιηθούν σε όλους τους τύπους κυττάρων τροφοβλάστη, τους πιο άφθονους κυτταρικούς τύπους του πλακούντα. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα TS αντιπροσωπεύουν το πιο φυσιολογικό in vitro σύστημα για τη μελέτη της διαφοροποίησης τροφοβλαστικών κυττάρων και της ανάπτυξης του πλακούντα. Τα τέσσερα κύρια νέα ευρήματα της in vivo εργασίας μας είναι τα ακόλουθα. Πρώτον, διερευνήσαμε την κλινικά σημαντική αλλά σχετικά ακαθόριστη διασπορά των αρχικά στενά συνδεδεμένων δεσμίδων λείων μυών του εσωτερικού μυομητρίου. Δείχνουμε ότι περιορίζεται στο εσωτερικό μυομήτριο του μεσομητριακού μισού της μήτρας και ξεκινά κατά την περίοδο περιεμφυτεύσεως, μεταξύ της εμβρυϊκής ημέρας 3.5 (Ε3.5) και Ε5.5. Αυτό συμβαίνει στην απουσία κυττάρων uNK (κλινικά σημαντικά μητρικά λεμφοκύτταρα που συσσωρεύονται στη μήτρα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης) και σχετίζεται με αυξήσεις στην αφθονία προϋπάρχοντων κυττάρων του στρώματος του εσωτερικού μυομητρίου, αποκλείοντας έτσι τα πρώτα και εμπλέκοντας τα δεύτερα στην έναρξη της διασποράς (dispersal) του εσωτερικού μυομητρίου. Δεύτερον, εξετάσαμε τη ιστολογική σύνθεση του μητρικού αδένα/μεσομητριακού λεμφικού συσσωματώματος της εγκυμοσύνης (MG/MLAp), μιας ειδικής για τρωκτικά και παροδικής δομής της μήτρας επαγόμενης από εγκυμοσύνη που απαιτείται για επιτυχή εγκυμοσύνη, η οποία ορίζεται ως οποιαδήποτε περιοχή μεσομητριακά του φθαρτού υμένα (decidua basalis) που συσσωρεύει uNKs. Αν και θεωρείται ότι το MG/MLAp του ποντικιού, όπως και το αντίστοιχο του αρουραίου, αποτελείται τόσο από το μεσομητριακό τρίγωνο όσο και από το διεσπαρμένο εσωτερικό μυομήτριο, αυτό ποτέ δεν διερευνήθηκε ευθέως στα ποντίκια. Εδώ ορίσαμε τα ανεπαρκώς περιγραφόμενα όρια του μεσομητριακού τριγώνου και δείξαμε ότι το MG/MLAp του ποντικού αποτελείται μόνο από το διεσπαρμένο εσωτερικό μυομήτριο. Ως εκ τούτου, παρέχουμε νέα δεδομένα για πιο ενημερωμένες συγκρίσεις μεταξύ των ειδών όσον αφορά φαινόμενα που σχετίζονται με την εγκυμοσύνη. Τρίτον, διερευνήσαμε άγνωστες πτυχές της κλινικά σημαντικής φθαρτοποίησης (decidualization) εντός του μεσομητριακού μισού της μήτρας. Αν και αυτός ο σταδιακός μετασχηματισμός των αρχικά χαλαρά διατεταγμένων κυττάρων ενδομητριακού στρώματος σε στενά διατεταγμένα και διαφοροποιημένα κύτταρα φθαρτού (decidua cells) είναι καλά χαρακτηρισμένος στο αντιμεσομητριακό φθαρτό (antimesometrial decidua), η εξέλιξή του στο μεσομητριακό μισό της μήτρας χρειάζεται περεταίρω διερεύνηση. Με βάση την εξέταση του αντιμεσομητριακού φθαρτού, αναπτύξαμε έναν νέο συνδυασμό ιστολογικών και μοριακών εργαλείων για να προσδιορίσουμε καλύτερα τα διαφορετικά στάδια ωρίμανσης της φθαρτοποίησης. Χρησιμοποιώντας αυτά, παρέχουμε στοιχεία ότι: (α) το στρώμα του διασκορπισμένου εσωτερικού μυομητρίου βιώνει φθαρτοποίηση σε ένα συγκεκριμένο στάδιο ωρίμανσης, υποδεικνύοντας έτσι ότι η φθαρτοποίηση δεν περιορίζεται μόνο στο ενδομήτριο όπως αρχικά θεωρήθηκε, και (β) ο συμπαγής ιστός που περιβάλλει τις σπειροειδείς αρτηρίες (κλινικά σημαντικές αρτηρίες μέσω των οποίων το μητρικό αίμα εισέρχεται στον πλακούντα) εντός της εξωτερικής περιοχής του φθαρτού υμένα, δεν είναι μέρος του αρτηριακού τοιχώματος όπως συχνά θεωρείται, αλλά αντιπροσωπεύει μια ώριμη κατάσταση φθαρτοποίησης του ενδομητριακού στρώματος. Τέλος, αν και η εισβολή του τροφοβλάστη στο πλακουντιακό bed (μια κλινικά σημαντική διαδικασία εγκυμοσύνης) είναι βαθιά σε ανθρώπους και αρουραίους καθώς εκτείνεται πέρα από τον φθαρτό υμένα, θεωρείται ότι αυτό δεν συμβαίνει στα ποντίκια. Ωστόσο, δείχνουμε ότι αυτή η βαθιά εισβολή είναι επίσης χαρακτηριστικό της εγκυμοσύνης σε ποντίκια, αλλά εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο. Επιπλέον, αναπτύξαμε το πρώτο γενετικό in vivo μοντέλο βαθιάς εισβολής στα ποντίκια και το χρησιμοποιήσαμε για να δείξουμε ότι ανεπαρκής βαθιά τροφοβλαστική εισβολή σχετίζεται με μειωμένο εμβρυϊκό μεγάλωμα. Ως εκ τούτου, δείχνουμε ότι η πλακουντιακή περιοχή (placenta bed) του ποντικού, όπως και το αντίστοιχο του στους ανθρώπους, περιλαμβάνει τον φθαρτό υμένα και το παρακείμενο του διεσπαρμένο εσωτερικό μυομήτριο, επικυρώνοντας έτσι το ποντίκι ως μοντέλο για τη διερεύνηση βαθιάς τροφοβλαστικής εισβολής. Οι κύριες ανακαλύψεις της in vitro εργασίας μας με κύτταρα TS είναι δυο και αφορούν τη βιολογία των συμβατικών συνθηκών καλλιέργειας αυτοανανέωσης κυττάρων TS, οι οποίες περιλαμβάνουν ορό συμπληρωμένο με αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2/4 (Fibroblast growth factor 2/4 - Fgf2/4) και Activin. Πρώτον, αν και τα κύτταρα TS μπορούν να διατηρηθούν σε επικαλυμμένες με Matrigel επιφάνειες σε μέσα χωρίς ορό στη παρουσία Fgf2/4 και αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης - βήτα1 (TGF-beta1), δεν είναι γνωστό εάν το Activin και το TGF-beta1 είναι εναλλάξιμα, όπως συμβαίνει στις συμβατικές συνθήκες καλλιέργειας που περιέχουν ορό. Δείχνουμε ότι η Activin μπορεί να αντικαταστήσει τον TGF-beta1 σε μέσα καλλιέργειας χωρίς ορό, και ως αποτέλεσμα αυτό αποτελεί μια νέα συνθήκη καλλιέργειας διατήρησης κυττάρων TS χωρίς ορό. Δεύτερον, αν και ο κύριος ρόλος του ορού στη συμβατική καλλιέργεια πιστεύεται ότι είναι η παροχή συστατικών εξωκυτταρικού υποστρώματος για προσκόλληση κυττάρων TS στην επιφάνεια καλλιέργειας, αυτό δεν έχει ποτέ εξεταστεί ευθέως. Τα ευρήματά μας επικυρώνουν αυτόν τον ισχυρισμό και το σύστημα καλλιέργειας που χρησιμοποιήσαμε για να το δείξουμε αυτό, αποτελεί μια επιπλέον νέα συνθήκη καλλιέργειας συντήρησης κυττάρων TS.

This thesis used the mouse model to investigate underexplored and clinically significant processes and structures during pregnancy in vivo and unknown aspects about the biology of trophoblast stem (TS) cells in vitro. Our in vivo investigations focused on pregnancy-induced changes in specific regions of the adult uterus: the placental bed and two of its associated uterine structures, the inner myometrium, and the mesometrial triangle. Our in vitro work was on TS cells, one of the three fundamental stem cell types derived from the early embryo. TS cells have indefinite self-renewal and can be differentiated in all trophoblast cell types, the most abundant cell types of the placenta. Consequently, TS cells represent the most physiologically relevant in vitro system for the study of trophoblast differentiation and placenta development. The four major novel findings of our in vivo work are as follows. First, we show that the dispersal of the initially closely packed smooth muscle bundles of the inner myometrium is confined to the inner myometrium of the mesometrial half of the uterus and initiates during the peri-implantation period, between embryonic day 3.5 (E3.5) and E5.5. This occurs in the absence of uterine Natural Killer (uNK) cells and is associated with increases in the abundance of pre-existing inner myometrium stroma cells. Second, we defined the ill-described borders of the mesometrial triangle and show that the mouse metrial gland/mesometrial lymphoid aggregate of pregnancy (MG/MLAp) only consists of the dispersed inner myometrium. Third, based on our examination of antimesometrial decidualization, we developed a new combination of histological and molecular tools to better define the different decidualization maturation stages. Using these, we provide evidence that: (a) the stroma of the dispersed inner myometrium decidualizes to a specific stage of maturation, and (b) the compact tissue surrounding spiral arteries (arteries through which maternal blood enters the placenta) within the outer region of decidua basalis, is not part of the arterial wall as often viewed, but represents a mature state of decidualized stroma. Lastly, although trophoblast invasion into the placental bed (a clinically significant pregnancy process) is deep in humans and rats, it is assumed that this is not the case in mice. However, we show that this deep invasion is also a feature of mouse pregnancy, but it is genetic background-dependent. Moreover, we developed the first genetic in vivo mouse model of deep invasion and used it to show that compromised deep invasion is associated with reduced fetal growth. The main discoveries of our in vitro work with TS cells are two-fold. First, we show that Activin can replace TGF-beta1 in serum-free media, and as a result this constitutes a novel serum-free TS cell maintenance culture condition. Second, although the main role of serum in conventional culture is thought to be the provision of extracellular matrix components for TS cell attachment, this has never been directly tested. Our findings validate this assertion and the culture system we used to show this, constitutes an additional new TS cell maintenance culture condition.