Functional characterization of the endoplasmic reticulum and nuclear envelope transmembrane protein TMEM147 in HeLa cells

Abstract

Το Ενδοπλασματικό Δίκτυο (ΕR) είναι το μεγαλύτερο μεμβρανικό κυτταροπλασματικό διαμέρισμα με ποικιλία λειτουργιών που περιλαμβάνουν τη σύνθεση και επεξεργασία πρωτεϊνών, αποθήκευση ασβεστίου και τη βιοσύνθεση χοληστερόλης και λιπιδίων. Αποτελείται από τον πυρηνικό φάκελο (NE) και το περιφερειακό ER, που διακρίνεται σε δύο περιοχές αποτελούμενες από επίπεδους σακοειδείς σχηματισμούς (cisternae) και το σωληνοειδές δίκτυο (tubules). Η διαμεμβρανική πρωτεΐνη TMEM147 εμπλέκεται στη μεταφορά του μουσκαρινικού υποδοχέα 3 της ακετυλχολίνης, στη σταθεροποίηση του πρωτεϊνικού συμπλόκου Nicalin-NOMO στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος nodal και την ενεργοποίηση των μεταφραστικών παραγόντων τύπου NF-κB. Σε αυτή την εργασία καθορίσαμε ότι σε κύτταρα HeLa, η ΤΜΕΜ147 βρίσκεται στις μεμβράνες του ΕR και του NE και περιγράφουμε τη φυσική αλληλεπίδραση και λειτουργική σχέση με τον υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR), πρωτεΐνης του NE. Βρήκαμε ότι η μειορύθμιση της ΤΜΕΜ147 ρυθμίζει αρνητικά τη γονιδιακή έκφραση και τα πρωτεϊνικά επίπεδα του LBR, διαταράσσοντας επίσης το σωστό εντοπισμό του στην εσωτερική μεμβράνη του NE (INM) και προκαλώντας την διασπορά του στις μεμβράνες του περιφερειακού ΕR. Η αποσιώπηση της ΤΜΕΜ147 ακολουθείται από περαιτέρω αλλαγές στην οργάνωση των μεμβρανών του ΕR, αλλαγές στο σχήμα του πυρήνα και τη συσπείρωση της χρωματίνης, όπως επίσης μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Ο LBR είναι δομικά και λειτουργικά μια αρθρωτή πρωτεΐνη. Η αμινοτελική του περιοχή προβάλει στο νουκλεόπλασμα και εμπλέκεται στην αγκυροβόληση και την οργάνωση της ετεροχρωματίνης, ενώ η καρβοξυτελική του περιοχή εκτείνεται προς το κυτταρόπλασμα και εμπεριέχει ενζυμική ενεργότητα αναγωγάσης της χοληστερόλης που καταγράφουμε ως ουσιώδη για την φυσική του αλληλεπίδραση με την ΤΜΕΜ147. Διαπιστώσαμε ότι η DHCR7, μια άλλη αναγωγάση-κλειδί των στερολών, που καταλύει την σύνθεση της χοληστερόλης, επίσης αλληλεπιδρά με την ΤΜΕΜ147 και, όπως ο LBR, μειορυθμίζεται παράλληλα με τη μείωση των επιπέδων της ΤΜΕΜ147, τόσο σε πρωτεϊνικό επίπεδο όσο και σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Πρωτεομική ανάλυση των αλληλεπιδράσεων της ΤΜΕΜ147 κατέδειξε την αλληλεπίδραση της με μια άλλη αναγωγάση των στερολών, την TM7SF2, της οποίας η γονιδιακή έκφραση δεν εναρμονίζεται με αυτήν της ΤΜΕΜ147. Ακόμα, στην εργασία αυτή αναδεικνύεται ότι η αποσιώπηση της ΤΜΕΜ147 μεταβάλλει το λιπιδικό προφίλ των κυττάρων συμπεριλαμβανομένων αλλαγών των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης και ειδών των εστέρων της χοληστερόλης, όπως επίσης ότι η μείωση των επιπέδων της ΤΜΕΜ147 τροποποιεί τη διαμεσολαβούμενη από υποδοχέα πρόσληψη της χοληστερόλης από τα κύτταρα. Προσθήκη εξωγενούς χοληστερόλης σε αποσιωποιημένα για την ΤΜΕΜ147 κύτταρα σε συνθήκες λιπιδικής πενίας, επανέφερε την κυτταρική βιωσιμότητα και ανάπτυξη ενώ προκάλεσε μόνο μικρή βελτίωση στα κύτταρα σε πειράματα ελέγχου. Τα πιο πάνω ευρήματα σκιαγραφούν την ΤΜΕΜ147 ως ένα νέο πιθανό ρυθμιστή της ομοιόστασης της χοληστερόλης στα ανθρώπινα κύτταρα. Συμπληρωματικά, διενεργήσαμε ανάλυση των πρωτεινικών δικτύων και μονοπατιών ενός δια χειρός επιμελημένου (manually curated) καταλόγου από αλληλεπιδρώσες πρωτεΐνες, συμπαράγοντες και τροποποιητές της ΤΜΕΜ147. Η ανάλυση των μονοπατιών ταυτοποίησε τέσσερα κύρια μονοπάτια όπου συμπεριλαμβάνονται η ενεργότητα υποδοχέα συζευγμένη με πρωτεΐνη G, η σύνδεση με ριβοσώματα, η ενεργότητα οξειδοαναγωγάσης και η ενεργότητα διαμεμβρανικής μεταφοράς, ενώ η ανάλυση των πρωτεϊνικών δικτύων αναγνώρισε πρωτεΐνες-κόμβους σε αυτά τα μονοπάτια. Συσχέτιση των ταυτοποιημένων μονοπατιών και των πρωτεϊνών-κόμβων μπορούν να θεωρηθούν ως μελλοντικοί ερευνητικοί στόχοι για περαιτέρω λειτουργική διερεύνηση της ΤΜΕΜ147.

The Endoplasmic Reticulum (ER) is the largest membrane-bound cytoplasmic compartment with diverse functionality, including protein synthesis and processing, calcium storage, and lipid and cholesterol biosynthesis. It comprises the nuclear envelope (NE) and the peripheral ER, further divided to the distinct subdomains of flat cisternae sheets and the tubular network. Transmembrane protein TMEM147 has been implicated in muscarinic receptor 3 (M3R) trafficking, in the stabilization of the Nicalin-NOMO protein complex in nodal signaling, and in the activation of NF-κB transcription factors. In this work, we report TMEM147 as a resident protein of the ER and NE membrane in HeLa cells and describe its physical and functional association with the NE protein lamin B receptor (LBR). We find that downregulation of TMEM147 negatively regulates both gene expression and protein levels of LBR and disrupts its proper inner nuclear membrane (INM) localization, causing its dispersion to the peripheral ER membranes. Silencing of TMEM147 is accompanied by further changes in ER membrane domain organization and changes in nuclear shape and loss of chromatin compaction as well as decreased cell viability. LBR is structurally and functionally a modular protein. Its N-terminus protrudes to the nucleoplasm and is known to be involved in anchoring and organizing heterochromatin, while its C-terminus in the INM extends towards the cytoplasm and hosts a cholesterol reductase activity that we document as essential for the interaction with TMEM147. We determined that DHCR7, another key sterol reductase, catalyzing cholesterol synthesis, also interacts with TMEM147 and, similar to LBR, is downregulated upon TMEM147 depletion at both protein and gene expression levels. Our proteomic analysis of the TMEM147 interactome also revealed an interaction of TMEM147 with sterol reductase TM7SF2, whose gene expression however we found not to be co-ordinated with that of TMEM147. Here we also report that silencing of TMEM147 alters the lipidomic profile of the cells, including total cholesterol levels and cholesteryl ester species and its depletion also modulates the receptor-mediated uptake of cholesterol by cells. Addition of exogenous cholesterol in TMEM147-silenced and lipid starved cells rescued cell viability and growth while it had a modest ameliorating effect on control cells. Taken together, our findings illuminate TMEM147 as a new likely regulator of cholesterol homeostasis in human cells. Complementary to this work, we conducted a protein network and pathway analysis of a manually curated list of TMEM147 interactors, co-factors and modulators. Pathway analysis identified four major pathways including G protein-coupled receptor activity, ribosome binding, oxidoreductase activity, and transmembrane transport activity, while protein network analysis identified hub proteins of these corresponding pathways. Association of identified pathways and network hub proteins can be regarded as future research pointers to further TMEM147 functional studies.