Investigating the role of the genetic background and Chitin Binding Domain proteins in intestinal homeostasis and regeneration in Drosophila
Date
2023-05-22Author
Ignatiou, Anastasia A.Publisher
Πανεπιστήμιο Κύπρου, Σχολή Θετικών και Εφαρμοσμένων Επιστημών / University of Cyprus, Faculty of Pure and Applied SciencesPlace of publication
CyprusGoogle Scholar check
Keyword(s):
Metadata
Show full item recordAbstract
Η φρουτόμυγα, Drosophila melanogaster, αποτελεί ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη της εντερικής ομοιόστασης, αναγέννησης και ογκογένεσης, λόγω του ότι το έντερό της παρουσιάζει μοριακές, κυτταρικές και λειτουργικές ομοιότητες με το έντερο των θηλαστικών. Σε αυτή τη διατριβή, αξιολόγησα τον ρόλο του γενετικού υποβάθρου στην εντερική ομοιόσταση και την επαγόμενη από λοιμώξεις αναγέννηση, και επίσης χαρακτήρισα νέους ρυθμιστές της εντερικής ομοιόστασης και ογκογένεσης.
Για να ελέγξουμε τη φαινοτυπική ποικιλομορφία ποσοτικών χαρακτηριστικών, εξετάσαμε αγρίου τύπου αμιγή στελέχη Δροσόφιλας της συλλογής DGRP (Drosophila Genetics Reference Panel) για έξι χαρακτηριστικά φυσιολογίας και αρμοστικότητας. Βρήκαμε ότι η γονιμότητα των θηλυκών, η επιβίωση, η εντερική μίτωση, ο ρυθμός αφόδευσης και το pH των κοπράνων κατόπιν βακτηριακής μόλυνσης, καθώς και η αναδιαμόρφωση των τερματικών τραχειακών κυττάρων στην υποξία εμφάνισαν συνεχή ποικιλομορφία. Επιπλέον, ελέγξαμε ευρείας χρήσης UAS-RNAi διαγονιδιακά στελέχη του Vienna Drosophila Resource Center και τα ισογονικά ομόλογά τους για να αξιολογήσουμε τις επιδράσεις του γενετικού υποβάθρου στα παραπάνω χαρακτηριστικά, και επιπλέον της εντερικής μίτωσης απουσία μόλυνσης, και της αναδιαμόρφωσης των τραχειακών κυττάρων σε φυσιολογική συγκέντρωση οξυγόνου. Τα τυχαία επιλεγμένα 20 UAS-RNAi στελέχη και τα ισογονικά τους ισοδύναμα εξετάστηκαν χωρίς επαγωγή με Gal4. Η επιβίωση κατόπιν μόλυνσης και η θηλυκή γονιμότητα εμφάνισαν διαφορές στο 50% και 40% των εξεταζόμενων ισογονικών έναντι μη ισογονικών ζευγών, η εντερική μίτωση με και χωρίς μόλυνση εμφάνισε διαφορές στο 25% και όλα τα άλλα χαρακτηριστικά επηρεάστηκαν μόνο στο 10-20% των περιπτώσεων. Επιπλέον, όταν ένα μεμονωμένο UAS-RNAi στέλεχος διασταυρώθηκε με τον ίδιο Gal4 οδηγό που είχε εισήχθη σε διαφορετικά γενετικά υπόβαθρα, η ποσοτική ποικιλομορφία που παρατηρήθηκε ήταν απρόβλεπτη με βάση τον φαινότυπο του αμιγούς στελέχους. Επομένως, κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, ανεξάρτητα από το χαρακτηριστικό ενδιαφέροντος, πρέπει να λαμβάνεται προσεκτικά υπόψη το γενετικό υπόβαθρο των διαγονιδιακών στελεχών που χρησιμοποιούνται.
Για να ανακαλύψουμε νέους ρυθμιστές της εντερικής ογκογένεσης, χρησιμοποιήσαμε αντίστροφη γενετική για να ελέγξουμε τον ρόλο 55 γονιδίων με διαφορική έκφραση σε καρκινικά έντερα της μύγας, τα οποία είχαν ταυτοποιηθεί μέσω ανάλυσης ολικού μεταγραφήματος. Κάθε υποψήφιο γονίδιο αποσιωπήθηκε μεμονωμένα στα καρκινικά μεσέντερα που εξέφραζαν το ογκογονίδιο Ras1* και ποσοτικοποιήθηκε η εντερική μίτωση ως ένδειξη μεγέθους του όγκου. Για περαιτέρω ανάλυση επιλέξαμε τα CG13309, CG7298 και CG10154, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που φέρουν περιοχή πρόσδεσης στη χιτίνη (chitin-binding domain: CBD) και μείωναν σημαντικά την ογκογένεση Ras, όταν αποσιωπήθηκαν. Βρήκαμε ότι σε μη καρκινικά έντερα τα CG13309 και CG10154 ήταν απαραίτητα στα εντερικά βλαστοκύτταρα (intestinal stem cells: ISCs) για την επαγόμενη από βλάβη ISC-μεσολαβούμενη αναγέννηση του μεσεντέρου. Επιπλέον, η υπερέκφραση των CG13309 και CG10154 ειδικά στα ΙSCs ήταν επαρκής για να επάγει τη μίτωση του εντέρου σε συνθήκες ομοιόστασης. Το CG7298 αποδείχθηκε ότι παίζει ρόλο μόνο κατά την ογκογένεση. Για να κατανοήσουμε περαιτέρω τη λειτουργία των CBD γονιδίων, δημιουργήσαμε ένα αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης CG13309. Βρήκαμε ότι στα μεσέντερα αγρίου τύπου, η πρωτεΐνη CG13309 συσχετίστηκε στενά με τους εντερικούς προγονικούς πληθυσμούς και ο κοκκώδης εντοπισμός της ήταν εξωκυτταρικός. Μέσω μωσαϊκής γενετικής ανάλυσης και μελέτη συνέκφρασης κυτταρικών δεικτών κατά την αποσιώπηση του CG13309, αποδείξαμε ότι το CG13309 ήταν απαραίτητο για τη μίτωση των ISCs αλλά όχι για τη διατήρηση ή τη διαφοροποίησή τους.
Πραγματοποιήσαμε επίσης διάφορα πειράματα ελέγχου της φυσιολογίας σε CG13309-αποσιωπημένα μεσέντερα. Δεν βρήκαμε καμία επίδραση όσον αφορά την επιβίωση της μύγας κατόπιν μόλυνσης, αλλά αντιφατικά αποτελέσματα προέκυψαν σχετικά με τη διαπερατότητα του εντερικού φραγμού, τα οποία χρήζουν περαιτέρω έρευνας. Επιπλέον, για τον εντοπισμό τελεστών της λειτουργίας του CG13309 στο ενήλικο έντερο, πραγματοποιήσαμε ανάλυση αντίστροφης μεταγραφής ακολουθούμενης από αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Real time-quantitative polymerase chain reaction: RT-qPCR) σε μεσέντερα ελέγχου και σε CG13309- αποσιωπημένα μεσέντερα σε συνθήκες ογκογένεσης, ομοιόστασης και αναγέννησης. Βρήκαμε αλλαγές στην έκφραση των ρυθμιστών της εντερικής μίτωσης συμπεριλαμβανομένων των προσδετών των Notch, EGFR, Toll και Jak-Stat σηματοδοτικών μονοπατιών. Τέλος, για να ανακαλύψουμε νέους τελεστές των CBD γονιδίων, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ολικού μεταγραφήματος με τη μέθοδο mRNA-Seq σε έντερα ελέγχου και έντερα με αποσιωπημένο το CG13309 και CG10154 σε συνθήκες ομοιόστασης και αναγέννησης. Η προκαταρκτική ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης ταυτοποίησε μια κοινή ομάδα γονιδίων με δραστηριότητα λυσοζύμης και διαμεμβρανικές περιοχές, τα οποία χρήζουν περαιτέρω έρευνας. Δεδομένου ότι τα γονίδια CBD της μύγας κωδικοποιούν μικρά εκκρινόμενα πεπτίδια που σχετίζονται με όγκους και παρουσιάζουν ομοιότητα αλληλουχίας με τις ανθρώπινες λεκτίνες χιτίνης, η μελλοντική μας έρευνα μπορεί να παρέχει μηχανιστικές γνώσεις για τη δράση των ανθρώπινων λεκτινών χιτίνης, οι οποίες υπερεκφράζονται στον καρκίνο του παχέος εντέρου και τη φλεγμονή. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is an ideal model to study intestinal homeostasis, regeneration and tumorigenesis because its midgut exhibits molecular, cellular and functional similarities with the mammalian gut. In this thesis, I assessed the role of the genetic background in intestinal homeostasis and infection-induced regeneration, and I also characterized novel intestinal homeostasis and tumorigenesis regulators.
To test the phenotypic variation of complex traits, we screened the Drosophila Genetics Reference Panel collection of inbred isogenic strains for six physiological and fitness traits. We found that female fecundity, survival and intestinal mitosis upon oral infection, defecation rate and fecal pH upon oral infection, and terminal tracheal cell branching in hypoxia exhibited continuous variation. Furthermore, we assessed the effects of commonly used UAS-RNAi transgenic strains of the Vienna Drosophila Resource Center and their isogenized counterparts in the same traits, plus intestinal mitosis without infection and tracheal branching in normoxia. The randomly selected 20 non-isogenic UAS-RNAi strains and their isogenic equivalents were tested without Gal4 induction. Survival upon infection and female fecundity exhibited differences in 50% and 40% of the tested isogenic vs. non-isogenic pairs, intestinal mitosis with and without infection varied by 25% and all other traits were affected in only 10-20% of the cases. Furthermore, when a single UAS-RNAi line was crossed with the same Gal4 driver inserted in different genetic backgrounds, the quantitative variations observed were unpredictable on the basis of pure line performance. Thus, irrespective of the trait of interest, the genetic background of commonly used transgenic strains needs to be considered carefully during experimentation.
To identify novel regulators of intestinal tumorigenesis, we used reverse genetics to test the role of 55 genes with differential expression in tumorous fly intestines identified through transcriptomics. Each candidate gene was individually silenced in Ras* tumorous midguts and intestinal mitosis was monitored as a tumor growth proxy. We selected CG13309, CG7298 and CG10154, which encode chitin-binding domain (CBD) proteins, and significantly reduced Ras tumorigenesis when silenced, for further analysis. We found that, in non-tumorous midguts, CG13309 and CG10154 were necessary in ISCs for damage-induced ISC-mediated midgut regeneration. Furthermore, CG13309 and CG10154 ISC-specific overexpression was sufficient to drive midgut mitosis in the absence of damage. CG7298 was shown to have only a tumor-specific role. To further understand CBD gene function, we raised an antibody against CG13309. We found that in wild-type midguts, the CG13309 protein was closely associated with intestinal progenitors and its punctate localization was extracellular. Through mosaic clonal analysis and marker co-expression upon CG13309 silencing, we showed that CG13309 was necessary for ISC mitosis but not maintenance or differentiation. We also tested gut physiology in CG13309-silenced midguts. We found no effect on fly survival upon infection, but contradictory results regarding intestinal barrier permeability that need further investigation. Moreover, to identify effectors of CG13309 function in the adult intestine, we performed RT-qPCR in control and CG13309-silenced midguts both in tumorigenic and under homeostatic and regeneration conditions, which revealed changes in expression of ISC mitosis regulators including ligands of the Notch, EGFR, Toll, and Jak-Stat pathways. Last, to identify novel effectors of CBD genes, we performed mRNA-Seq transcriptomics of control vs. ISC-specific CG13309- and CG10154-silenced midguts in baseline and infection conditions. Preliminary gene expression enrichment analysis identified a common signature of genes with lysozyme activity and transmembrane domains upon CBD silencing, that require further experimentation. Since the fly CBD genes encode small secreted peptides associating with tumors with sequence similarity to human chitin lectins, our future research can provide mechanistic insights into the action of human chitin lectins, which are upregulated in colon cancer and inflammation.