Αντικαρκινική δράση των συνθετικών αναλόγων ιντιρουπίνης 6-bromoindirubin-3'-oxime και 7-bromoindirubin-3'-oxime σε καρκινικά κύτταρα μαστού, προστάτη και οστεοσαρκώματος

Abstract

Στο πλαίσιο αυτής της διδακτορικής διατριβής επιχειρήθηκε μια επιστημονική προσέγγιση στη πρόληψη και θεραπεία των μεταστατικών καρκίνων του προστάτη, οστεοσαρκώματος και μαστού, χρησιμοποιώντας συνθετικά ανάλογα φυτικών ουσιών οι οποίες υπάγονται στην κατηγορία των ιντικοειδών και συγκεκριμένα της ουσίας ιντιρουπίνης. Στη παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν τα συνθετικά ανάλογα της ιντιρουπίνης 6-bromoindirubin-3΄-oxime (6ΒΙΟ) και 7-bromoindirubin-3΄-oxime (7ΒΙΟ), ουσίες με καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα και κυτταροτοξική δράση από την ιντιρουπίνη, καθώς και ισχυρότερη κατασταλτική δράση έναντι των κινασών CDK και GSK-3b[1]. Η δράση των ουσιών 6ΒΙΟ και 7ΒΙΟ μελετήθηκε σε in vitro καλλιέργειες κυττάρων καρκίνου του προστάτη DU145, PC3 και LNCaP, οστεοσαρκώματος KHOS και καρκίνου του μαστού MDA-MB-231-TXSA, που έχουν μεταστατικό χαρακτήρα εκφράζοντας πρωτεάσες, όπως σύμπλοκα του συστήματος του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase type plasminogen activator system, uPA). Υποθέτουμε ότι ένα ή περισσότερα ανάλογα της ιντιρουπίνης παρουσιάζουν αντικαρκινική δράση, η οποία οφείλεται είτε στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων ή στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου σε αυτά ή στην αναστολή της διείσδυσης και μετάστασής τους ή σε συνδυασμού αυτών των φαινομένων. Αρχικός στόχος της παρούσας διατριβής, ήταν ο προσδιορισμός βελτιωμένης αντικαρκινικής δράσης των 6ΒΙΟ και 7ΒΙΟ, στα υπό μελέτη καρκινικά κύτταρα σε σχέση με το πατρικό μόριο, την ιντιρουπίνη. Στην συνέχεια μελετήθηκε ο επαγόμενος από τις ουσίες αυτές αποπτωτικός μηχανισμός και η συνδυασμένη δράση των ουσιών με άλλους αποπτωτικούς παράγοντες όπως είναι το Apomab και το TRAIL στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, με σκοπό την ενίσχυση της αντικαρκινικής τους ιδιότητας. Οι 6ΒΙΟ και 7ΒΙΟ μελετήθηκαν και για τη δράση τους σε παράγοντες που ευνοούν τη μετάσταση, όπως στην ενεργότητα του uPA και στη διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων. Η αντι-καρκινική και αντι-μεταστατική δραστικότητα των 6ΒΙΟ και 7ΒΙΟ εξετάστηκε και in vivo, σε μοντέλο ενοφθαλμισμού καρκινικών κυττάρων στο λιπώδη ιστό μαστού ποντικού. Τα αποτελέσματά μας απέδειξαν ότι οι ουσίες 6ΒΙΟ και 7ΒΙΟ παρουσιάζουν ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική και αποπτωτική δράση στα καρκινικά κύτταρα που μελετήθηκαν, ενεργοποιώντας διαφορετικά μονοπάτια ανάλογα με την κυτταρική σειρά στην οποία δρουν. Συγκεκριμένα, στα MDA-MB-231-TXSA κύτταρα το 6ΒΙΟ επάγει απόπτωση ενεργοποιώντας το εξαρτώμενο από τις κασπάσες αποπτωτικό μονοπάτι ενώ το 7ΒΙΟ καταστέλλει τον κυτταρικό κύκλο στην φάση G2 και στην συνέχεια επάγει απόπτωση ενεργοποιώντας κυρίως το ανεξάρτητο από κασπάσες αποπτωτικό μονοπάτι. Επίσης οι ουσίες μας επαναφέρουν την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων μαστού τα οποία είναι ανθεκτικά στο αποπτωτικό αντίσωμα Apomab, επάγοντας απόπτωση. Η αντικαρκινική δράση των 6ΒΙΟ και 7ΒΙΟ ενισχύεται μετά τον συνδυασμό τους με τους παράγοντες TRAIL και Apomab στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη ενεργοποιώντας το εξωγενές αποπτωτικό μονοπάτι. Επίσης το 6ΒΙΟ αλλά όχι το 7ΒΙΟ καταστέλει την διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων, όπως επίσης και την ενεργότητα της μεταστατικής πρωτεάσης uPA. Τέλος in vivo και οι δύο ουσίες μειώνουν την εξέλιξη του όγκου. Το 6ΒΙΟ παρουσιάζει αντιμεταστατικές ιδιότητες μειώνοντας το ποσοστό των μεταναστευμένων στους πνέυμονες καρκινικά κύτταρα, επιβεβαιώνοντας έτσι τα in vitro αποτελέσματα μας. Συμπερασματικά, στο πλαίσιο αυτής της διδακτορικής διατριβής, αποδείξαμε ότι οι 6BIO και 7ΒΙΟ αποτελούν βελτιωμένα ανάλογα της ιντιρουπίνης με σημαντική in vitro και in vivo δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων μαστού, προστάτη και οστεοσαρκώματος που ίσως θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον, μόνα τους ή σε συνδυασμό με άλλους γνωστούς αντικαρκινικούς παράγοντες, ως αντικαρκινικά φαρμακευτικά σκευάσματα με αντιμεταστατικό δυναμικό.

The objective of the present study was to evaluate and compare the anti-cancer properties of two novel bromo-substituted derivatives 6-bromoindirubin-3´-oxime (6BIO) and 7-bromoindirubin-3´-oxime (7BIO) which differ in the position of bromine in their chemical structure and have improved solubility compared to the parental compound; We investigated (1) the potency of the two compounds to induce apoptosis on several cancer cell lines including, prostate (DU145, PC3), osteosarcoma (KHOS) and breast cancer cells (MCF-7, ZR75, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-231-TXSA) and (2) the effect of the two compounds on metastatic parameters such as the activity of proteolytic enzymes and the invasive ability of these cell lines. We found that the highly metastatic MDA-MB-231-TXSA cells were the most sensitive to the anti-proliferative effects of both derivatives. Both, 6BIO and 7BIO, induced apoptosis as determined by the cell death ELISA assay. However, 6BIO produced substantial increase in caspase΄s activity and Poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage compared to marginal increases produced by 7BIO. Furthermore, a pan-caspase inhibitor [Z-VAD (OMe)-FMK] significantly reduced the level of apoptosis induced by 6BIO, while reducing only marginally the apoptotic effect of 7BIO. These results demonstrate that 6BIO triggers cell death via activation of the classical caspase-dependent pathway of apoptosis and 7BIO via the activation of caspase independent dominant pathway. The incubation of MDA-MB-231-TXSA cells with 7BIO also induced the up-regulation of p53 and p21 which was associated with a G2/M cell cycle arrest that preceded the induction of apoptosis. Furthermore, MDA-MB-231-TXSA cells resistant to Apomab were found to be responsive to the apoptotic effects of the above compounds. DU145, PC3 and KHOS cells were the most sensitive to the anti-metastatic and anti-invasive effect of 6BIO as determined by the uPA activity assay and by the use of Boyden Chambers, respectively. Similarly to amyloride, a uPA inhibitor, 6BIO (but not 7BIO) reduced uPA activity. In agreement with this, 6BIO (but not 7BIO) reduced substantially the invasive ability of these cells. Taken together our results show that, (1) both compounds induce apoptotic effects through different molecular pathways, and (2) 6BIO only exhibit anti-metastatic and anti-invasive properties. These differences in the mechanism of action between the two derivatives may prove useful in combination chemotherapy protocols for the treatment of cancer.