Προσδιορισμός των προϊόντων οξείδωσης της χοληστερόλης στα κυπριακά τρόφιμα με τη χρήση νέων βελτιωμένων αναλυτικών τεχνικών

Abstract

Tα προϊόντα οξείδωσης της χοληστερόλης (Cholesterol Oxidation Products, COPs) αποτελούν το ερευνητικό αντικείμενο της παρούσας εργασίας. Αρχικό κίνητρο για τη διενέργεια της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της ύπαρξης των εν λόγω ενώσεων στα κυπριακά τρόφιμα προκειμένου να αξιολογηθούν για πρώτη φορά ως πιθανές πηγές προέλευσης των COPs. Οι βασικές προκλήσεις που έπρεπε να αντιμετωπιστούν στην πορεία επίτευξης αυτού του στόχου ήταν η χαμηλή συγκέντρωσης τους στα υπό μελέτη δείγματα και η πολυπλοκότητα που χαρακτηρίζει τις μήτρες των τροφίμων. Η εφαρμογή αναλυτικών τεχνικών που διαθέτουν ακρίβεια, εξειδίκευση και ευαισθησία και η εύρεση ενός αξιόπιστου αναλυτικού πρωτοκόλλου, που επέτρεπε την εκλεκτική απομόνωση των επιθυμητών ενώσεων, αποτέλεσαν την απάντηση στις παρούσες προκλήσεις. Για την αποπεράτωση του ερευνητικού έργου ακολουθήθηκε συγκεκριμένη πειραματική πορεία. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση του διαχωρισμού και της ποσοτικής αποτίμησης των COPs στηριζόμενη στις θεμελιώδεις αρχές της χρωματογραφικής θεωρίας. Ακολούθησε αξιολόγηση των χαρακτηριστικών ποιότητας της μεθόδου μέσω της διαδικασίας της επικύρωσης, μια μελέτη απαραίτητη για τη διασφάλιση της εγκυρότητας των πειραματικών δεδομένων. Μείζονος σημασίας στόχο αποτέλεσε και η βελτιστοποίηση των συνθηκών του σταδίου προκατεργασίας των δειγμάτων. Από το σύνολο των δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν το πρωτόκολλο που παρουσίασε τις υψηλότερες ανακτήσεις και τη μικρότερη διακύμανση των αποτελεσμάτων, εφαρμόστηκε για την εκχύλιση του συνόλου των αναλυτών από τις εξεταζόμενες μήτρες. Η εφαρμογή της τελικής μεθόδου στην ανάλυση τροφίμων ήταν το τελευταίο και ίσως το μεγαλύτερης πρακτικής σημασίας στάδιο. Έχοντας λοιπόν ως αφετηρία τις υπάρχουσες βιβλιογραφικές πληροφορίες και τις προτεινόμενες μεθόδους, στο πρώτο στάδιο της ερευνητικής εργασίας επιχειρήθηκε ανάλυση των COPs με τη χρήση της τεχνικής της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) με ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού (UV-Vis). Εφαρμόζοντας ένα ισοκρατικό σύστημα διαλυτών ACN:MeOH:H2O:IPA σε αναλογία 67:27:5:1, ρυθμό ροής 0.8 mL/min και θερμοκρασία 10 °C επιτεύχθηκε πλήρης διαχωρισμός εντός 22 min. Στη συνέχεια η βέλτιστη μέθοδος εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για τον προσδιορισμό των COPs σε κυπριακά αλλαντικά. Οι αυξημένες ποσότητες που ανιχνεύτηκαν επιβεβαιώνουν την υποψία ότι η προετοιμασία των εν λόγω προϊόντων ευνοεί την οξείδωση της χοληστερόλης. Με την ολοκλήρωση της παρούσας πτυχής της εργασίας αναδείχθηκαν ορισμένες αδυναμίες, οι οποίες ωστόσο αξιοποιήθηκαν και αποτέλεσαν τη βάση για το σχεδιασμό μιας νέας ερευνητικής εργασίας. Συγκεκριμένα, η τεχνική HPLC χρησιμοποιήθηκε ευρύτατα για την ανάλυση των COPs ενώ η χρήση ανιχνευτή UV-Vis δεν παρείχε την επιθυμητή ευαισθησία. Η ανάγκη για εύρεση εναλλακτικής λύσης προκειμένου να ξεπεραστούν οι πιο πάνω περιορισμοί, μας οδήγησαν στην εφαρμογή, για πρώτη φορά, της υγρής χρωματογραφίας υπερύψηλης απόδοσης (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) σε σύζευξη με διαδοχική φασματομετρία μαζών (Tandem mass spectrometry, MS/MS) στην ανάλυση των COPs. Η εφαρμογή της εν λόγω τεχνικής επέτρεψε τη χρωματογραφική ανάλυση εντός 4.2 λεπτών και παράλληλα την απόκτηση δύο μεταβάσεων MRM ανά ένωση με καλή ευαισθησία, παρέχοντας, με τη σειρά της, μια αξιόπιστη επιβεβαίωση των COPs που ανιχνεύθηκαν στα δείγματα. Τέλος, μετά τα θετικά αποτελέσματα από την ανάλυση των κυπριακών αλλαντικών, το ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάστηκε στον προσδιορισμό των επιπέδων συγκέντρωσης των COPs σε ποικιλία τροφίμων κυπριακής προέλευσης ευρείας κατανάλωσης. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι η 7-κέτο και τα 7-υδρόξυ παράγωγα αποτελούν τα κυρίαρχα COPs, ενώ τα επιβλαβή 5,6 εποξείδια προσδιορίστηκαν σε μικρότερες συγκεντρώσεις.

The goal of the research reported in this dissertation is to investigate the presence of cholesterol oxidation products (COPs) in Cypriot food, in order to be evaluated, for the first time, as potential sources of COPs. The main challenges that had to be addressed in order to achieve the particular objective were their low concentrations in the samples under study and the complexity of food matrices. The use of advanced analytical techniques with excellent precision and sensitivity and the development of a reliable analytical protocol that allowed the selective isolation of the desired compounds, were the answers to the present challenges. The above-mentioned objective was achieved by the use of a particular experimental procedure. Optimal separation conditions were initially established by using the fundamental principles of chromatographic theory. The developed methods were then validated through a procedure that is required to ensure the accuracy of experimental data. The most important step in an analytical protocol is the development of a reliable sample preparation procedure. The ideal procedure, which was determined based on recovery and precision, was applied for the selective isolation of COPs from food matrices. The first part of this research involves the development of a fast high-performance liquid chromatography method with ultraviolet-visible (UV-Vis) detector for the analysis of COPs. Baseline separation was achieved within 22 min by applying an isocratic solvent system of ACN:MeOH:H2O:IPA (67:27:5:1), a flow rate of 0.8 mL/min and a temperature of 10 °C. Then, COPs were detected and quantified, for the first time, in Cypriot meat products. Large amounts were detected, which confirm the suspicion that the preparation of the particular meat products favors the oxidation of cholesterol. Upon completion of this aspect of research work, a few weaknesses were highlighted, which, however, were utilized for the design of a new research project. In particular, while HPLC was widely utilized for the analysis of COPs, the use of UV-Vis detection did not provide the required sensitivity. The need to find an alternative to overcome the above-mentioned limitations, led us to apply, for the first time, Ultra High Performance Liquid Chromatography (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS) for the analysis of COPs. The use of the particular system allowed us to analyze all COPs within 4.2 min, while two MRM transitions per compound were obtained with high sensitivity, which, in turn, provided a reliable confirmation of the COPs detected in the samples. Finally, since positive results were obtained from the analysis of Cypriot meat products, in this study, research interest was focused on the qualitative and quantitative determination of COPs in a variety of widely consumed, traditional Cypriot foodstuffs. The experimental data obtained demonstrated that 7-keto and 7-hydroxy derivatives were the dominant COPs, while the harmful 5,6 epoxides were determined in lower concentrations.