Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός της πρωτεϊνης κινητήρα KIFC5A: ο πόλος της στη μιτωτική διαίρεση και η εμπλοκή της στο μηχανισμό διπλασιασμού του κεντροσωματίου

Abstract

Η παρούσα διδακτορική Διατριβή περιγράφει την ταυτοποίηση και το λειτουργικό χαρακτηρισμό της πρωτεΐνης κινητήρα τύπου κινησίνης, KIFC5A του ποντικού. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός της KIFC5A με συνδυασμό τεχνικών μοριακής, κυτταρικής βιολογίας, βιοχημείας και γενετικής περιλαμβάνει: την κλωνοποίηση και ταυτοποίηση της KIFC5A, την ανάλυση του αναπτυξιακού και τοπικού προτύπου της έκφρασης της KIFC5A, την περιγραφή του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης, κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ζωής, το χαρακτηρισμό των φυσικοχημικών ιδιοτήτων της KIFC5A και την κατανόηση του βιολογικού της ρόλου στο κύτταρο και συγκεκριμένα την περιγραφή της συνεισφοράς της στο σχηματισμό των αστέρων της μιτωτικής ατράκτου και τη δημιουργία διπολικής ατράκτου καθώς και τον πιθανό της ρόλο στο μηχανισμό διπλασιασμού του κεντροσωματίου. Η επεξεργασία των συνδυασμένων πειραματικών αποτελεσμάτων έδειξε πως η KIFC5A εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε κυτταρικούς τύπους και ιστούς με έντονη μιτωτική δραστηριότητα και το αναπτυξιακό και τοπικό πρότυπο γονιδιακής έκφρασης της βρίσκεται κάτω από ειδική ρύθμιση. Η KIFC5A, ως πρωτεΐνη κινητήρας παρουσιάζει ενζυμική ενεργότητα, ενεργοποιούμενης από τους μικροσωληνίσκους, ΑΤΡ-άσης (1.913·10-3 μmoleATP μgKIFC5A-s-1 min-1), κινείται προς το αρνητικό άκρο των μικροσωληνίσκων με ταχύτητα 1.26 ± 0.24 μm min-1, n=40 (για όρια εμπιστοσύνης 95%) και έχει την ικανότητα να προσδένει τους μικροσωληνίσκους σε δεμάτια (bundling). Κατά τη μεσόφαση παρουσιάζεται ως πυρηνική πρωτείνη ενώ κατά την έναρξη της μίτωσης εντοπίζεται στους αστέρες της μιτωτικής ατράκτου. Στις επόμενες φάσεις της μίτωσης διαχέεται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων της ατράκτου. Υπερέκφραση της πρωτεΐνης KIFC5A, με επιμόλυνση στην κυτταροσειρά NΙΗ3Τ3 ποντικού, προκαλεί στη μίτωση τη δημιουργία φαινοτύπου με μη κανονικά διαχωρισμένους αστέρες της μιτωτικής ατράκτου και εμπλοκή της διαδικασίας της μίτωσης στην προμετάφαση. Αποσιώπηση της πρωτεΐνης KIFC5A (RNA interference, RNAi) προκαλεί τη δημιουργία υπεράριθμων κεντροσωματίων που ανιχνεύονται σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Η αύξηση του αριθμού των κεντροσωματίων βρέθηκε να οφείλεται σε αναδιπλασιασμό των κεντροσωματίων και εν μέρει σε ελαττωματική διεκπεραίωση της κυτοκίνησης στη κυτταρική διαίρεση. Τα υπεράριθμα κεντροσωμάτια περιέχουν δύο κεντρίδια και έχουν την ικανότητα να αγκυροβολούν πολλούς μικρούς σε μήκος μικροσωληνίσκους σχηματίζοντας αστέρες οι οποίοι στη συνέχεια οργανώνονται με τη σειρά τους σε ανώμαλες πολυπολικές ατράκτους. Η KIFC5A βρέθηκε να αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες Nubp1 and Nubp2 (Nucleotide-Bindinq Proteins 1 and 2) οι οποίες παρουσιάζουν υψηλή αμινοξική ομοιότητα με την προκαρυωτική πρωτεΐνη MinD που συμμετέχει στον καθορισμό του σημείου σχηματισμού του δακτυλίου (septum) κυτταρικής διαίρεσης. Οι πρωτεΐνες Nubp1 και Nubp2 βρέθηκε επίσης ότι αλληλεπιδρούν και μεταξύ τους. Αποσιώπηση της πρωτεΐνης Nubp1 με RNAi δίνει πανομοιότυπο φαινότυπο με αυτόν που λαμβάνεται από την αποσιώπηση της KIFC5A. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η KIFC5A και οι πρωτεΐνες Nubp1 και Nubp2 εμπλέκονται από κοινού στο μηχανισμό ρύθμισης του διπλασιασμού των κεντροσωματίων.

This doctoral Thesis concerns the characterization of kinesin-like motor protein KIFC5A from mouse. The specific aims of this were aimed to investigate: the developmental tissue- and cell-specific expression profile of KIFC5A, the intracellular localisation of KIFC5A throughout the cell cycle, the biophysical properties of KIFC5A and elucidate the function of KIFC5A and in particular to understand in more depth its role in aster formation and in the definition of spindle bipolarity, address its functional association with the centrosome, and start unravelling its possible functional contribution to the centrosome cycle. Our combined experimental approaches revealed that KIFC5A is highly expressed in dividing cells and tissues maintaining mitotic activity and its pattern of expression is subject to developmental and cell type-specific regulation. KIFC5A is a minus end-directed microtubule-dependent motor with microtubule-stimulated ATP-ase activity of 1.913·10-3 μmoleATP μgKIFC5A-s-1 min-1, produces velocities of 1.26 ± 0.24 μm min-1 in gliding assays and possesses microtubule bundling activity. It is nuclear at interphase cells and localises to the asters of the nascent spindle and to spindle microtubules later at mitosis. Overexpression of KIFC5A in NIH3T3 mouse cells causes the formation of aberrant, non-separated asters and induces mitotic arrest in prometaphase. siRNA-mediated silencing of KIFC5A results in centrosome amplification. Supernumerary centrosomes are primarily a result of reduplication and partly of cytokinesis defects. They are detectable throughout the cell cycle, contain duplicated centrioles, have the ability to organise microtubule asters and result in the formation of multipolar spindles in mitosis. We show that KIFC5A interacts with Nucleotide-Binding Proteins 1 and 2 (Nubp1 and IMubp2), that are highly similar to prokaryotic division site-determining protein MinD. siRNA-mediated Nubp1 knockdown was found to phenocopy the KIFC5A silencing effect. These results implicate KIFC5A Nubp1 and Nubp2 in a common regulatory pathway, involved in the control of centrosome duplication in mammalian cells.