Computational approaches for the identification of LIR-motifs in selective autophagy receptor and adaptor proteins

Abstract

Η μακροαυτοφαγία (ή αυτοφαγία) αποτελεί εξελικτικά συντηρημένο ευκαρυωτικό καταβολικό μηχανισμό κυτταρικής ομοιόστασης. Υπό συνθήκες stress δημιουργούνται αυτοφαγοσώματα, διπλομεμβρανικά κυστίδια απομόνωσης κυτταροπλασματικού υλικού που οδηγείται σε αποικοδόμηση στα λυσοσώματα/κενοτόπια “ανακυκλώνοντας” δομικά στοιχεία του κυττάρου. Η αυτοφαγία συχνά εκτελείται επιλεκτικά, υποβοηθούμενη από πρωτεΐνες-υποδοχείς που προσδένουν τα φορτία με εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις. Ταυτόχρονα, μέσω ενός βραχέως γραμμικού μοτίβου (LIR-motif) προσδένουν πρωτεΐνες της οικογένειας Atg8, που βρίσκονται ομοιοπολικά συνδεδεμένες στη μεμβράνη του αυτοφαγοσώματος. Επιπλέον, πρωτεΐνες-προσαρμογείς αλληλεπιδρούν με τις Atg8 με LIR-motifs για την επιτέλεση άλλων αυτοφαγικών λειτουργιών. Κατά την περίοδο έναρξης αυτής της διδακτορικής διατριβής είχαν χαρακτηριστεί 25 περίπου πρωτεΐνες-υποδοχείς/προσαρμογείς της αυτοφαγίας και τα LIR-motifs τους. Εξετάσαμε τη δυνατότητα ανάπτυξης υπολογιστικών μεθόδων/εργαλείων χαρακτηρισμού LIR-motifs, στοχεύοντας στη διεύρυνση της γνώσης σχετικά με τις πρωτεΐνες υποδοχείς/προσαρμογείς. Συγκεκριμένα, έχοντας υπόψη προηγούμενες προσπάθειες περιγραφής των LIR-motifs, προτείναμε μια γενικευμένη κανονική έκφραση (xLIR) στοχεύοντας στην απόλυτη ευαισθησία. Αναμενόμενα, η προσέγγιση αυτή οδηγεί σε ανίχνευση πλήθους μοτίβων χωρίς βιολογική σημασία. Προκειμένου να μειώσουμε τον αριθμό τους, διατηρώντας ταυτόχρονα υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης των βιολογικά σημαντικών μοτίβων, αξιολογήσαμε συστηματικά πληθώρα συμπληρωματικών χαρακτηριστικών. Παρατηρώντας ότι (α) οι πρωτεΐνες της αυτοφαγίας τείνουν να περιέχουν εγγενώς μη δομημένες περιοχές (IDRs), και (β) βραχέα μοτίβα πρόσδεσης συχνά βρίσκονται σε IDRs, αρχικά επιβεβαιώσαμε ότι ισχύουν στο σύνολο αναφοράς και τις εφαρμόσαμε ως φίλτρο, βελτιώνοντας σημαντικά την ειδικότητα. Δείξαμε επίσης ότι η πιθανοθεωρητική αναπαράσταση των βιολογικά λειτουργικών LIR-motifs μέσω PSSMs αυξάνει περισσότερο την ειδικότητα, οδηγώντας σε προβλέψεις υψηλότερης ακρίβειας. Βασιζόμενοι στα παραπάνω, αναπτύξαμε την πρώτη σχετική μέθοδο στη βιβλιογραφία, η οποία διατίθεται ελεύθερα για χρήση στην ερευνητική κοινότητα (διαδικτυακή εφαρμογή iLIR). Στοχεύοντας να κατανοήσουμε σε βάθος τις σχέσεις της αμινοξικής ακολουθίας και των δομικών χαρακτηριστικών των πρωτεϊνών με λειτουργικά LIR-motifs και να βελτιώσουμε περαιτέρω την απόδοση της iLIR: (α) Μελετήσαμε συστηματικά διάφορες πηγές δεδομένων που αφορούν IDRs. Προτείνουμε πολύ-κριτηριακές προβλέψεις, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διαφορετικές εφαρμογές, στοχεύοντας σε υψηλότερη ειδικότητα ή ευαισθησία. (β) Πραγματοποιήσαμε συστηματική συλλογή πειραματικά προσδιορισμένων τρισδιάστατων δομών πρωτεϊνών της οικογένειας Atg8 και LIR-motifs. Μετά από προεπεξεργασία των δεδομένων για τον καθορισμό των περιοχών δέσμευσης των LIR-motifs, εκτελέσαμε πειράματα αγκυροβόλησης πεπτιδίων στις δομές “στόχους”, καταδεικνύοντας ότι μπορούμε με επιτυχία να αναγνωρίζουμε περιπτώσεις ειδικότητας αλληλεπίδρασης των LIR-motifs με συγκεκριμένα ομόλογα της Atg8. Αναπτύξαμε μια εξειδικευμένη βάση δεδομένων για την καταχώρηση και περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων, η οποία θα διατεθεί σύντομα προς χρήση. Στο ταχύτατα αναπτυσσόμενο αυτό ερευνητικό πεδίο είναι παρακινδυνευμένο να κάνει κανείς επιτυχημένες προβλέψεις των εξελίξεων σε βάθος χρόνου. Το γεγονός ότι σήμερα (συχνά με τη βοήθεια μεθόδων που αναπτύχθηκαν σε αυτή τη διατριβή) έχει πολλαπλασιαστεί η γνώση μας για τους υποδοχείς/προσαρμογείς της επιλεκτικής μακροαυτοφαγίας δημιουργεί νέες προοπτικές. Η αύξηση των διαθέσιμων δεδομένων αναφοράς επιτρέπει την ανάπτυξη εξελιγμένων μεθόδων πρόβλεψης (π.χ. βασισμένων σε τεχνικές μηχανικής μάθησης) που, σε συνδυασμό με δεδομένα μεταγραφομικής, μπορούν να προσφέρουν νέα γνώση για τους μηχανισμούς ρύθμισης της επιλεκτικής αυτοφαγίας σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, ιστούς και αναπτυξιακά στάδια. Παράλληλα, ανακαλύψεις νέων μοριακών οντοτήτων που εμπλέκονται ενεργά στην επιλεκτική αυτοφαγία (π.χ. ncRNAs) αναμένεται να μας προσφέρουν “εκπλήξεις” αλλά και νέο υλικό και πεδίο δράσης για πειραματισμό, τόσο στο εργαστήριο όσο και in silico.

Macroautophagy (hereinafter autophagy) is a catabolic, cellular homeostasis mechanism conserved throughout the eukaryotes. Under stress conditions, double membraned vesicles (autophagosomes) isolate cytoplasmic material, eventually targeted to the lysosome/vacuole for degradation, thus recycling structural blocks for use by the cell. Selective modes of autophagy are facilitated by receptor proteins capable of binding specific cargos via cargo-specific interactions. These receptors bind to members of the Atg8 protein family (conjugated to the autophagosome membrane) via short linear motifs (LIR-motifs). Furthermore, protein adaptors interact with Atg8 proteins via LIR-motifs for performing other autophagic functions. At the initiation of this PhD project approximately 25 selective autophagy receptors/adaptors had been characterized along with their LIR-motifs. We set to develop computational methods and tools for characterizing LIR-motifs, aiming to broaden our knowledge on selective autophagy receptors/adaptors. Based on previous attempts to describe LIR-motifs, we propose a generic regular expression (xLIR) aspiring to achieve absolute sensitivity. Expectedly, this approach leads to many false positive hits without any biological relevance. We systematically examined additional sequence-derived features to reduce false positives. Knowing that: a) autophagy proteins are enriched in intrinsically disordered regions (IDRs), and b) short linear motifs are often found in IDRs we confirm these observations in our reference autophagy receptor/adaptor dataset and, consequently, apply these principles as filters, leading to increased specificity. We also demonstrate that using a profile representation of LIR-motifs (in the form of a PSSM) further increases specificity, yielding high quality predictions. This work led to the first method of its kind reported in the literature, now freely available for use by the research community via the iLIR web server. In our quest for deeper understanding the relationships between aminoacid sequences and the structural features of proteins with functional LIR-motifs (and to further improve iLIR efficiency): a) We systematically studied different data resources regarding IDRs, proposing multi-scheme predictions, each suited for different applications aiming at higher specificity/sensitivity. b) We compiled a comprehensive collection of experimentally determined 3D-structures of Atg8 proteins and LIR-motifs. Following data pre-processing for defining the LIR-motif interaction interfaces, we conduct peptide docking experiments, illustrating that this approach is useful for predicting LIR