Screening for HbF inducing agents and evaluating the effect of metal ions on hydroxyurea's HbF inducing activity

Abstract

Η β-θαλασσαιμία είναι μια αιμοσφαιρινοπάθεια που χαρακτηρίζεται από ελάχιστη έως καθόλου παραγωγή β-σφαιρίνης. Η φαρμακευτική επανεργοποίηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης αποτελεί μια ελκυστική θεραπευτική προσέγγιση. Διάφοροι επαγωγείς της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης έχουν ανακαλυφθεί αλλά κανείς δεν έχει δείξει ικανοποιητικό κλινικό προφίλ και μόνο η υδροξυουρία έχει αναγνωριστεί από τον οργανισμό τροφίμων και φαρμάκων για τη θεραπέια της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Παρόλα αυτά η ανταπόκριση των ασθενών στην υδροξυουρία ποικίλει και η χρήση της στη β-θαλασσαιμία είναι περιορισμένη. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να ανακαλύψουμε νέους επαγωγείς της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης με ψηλή ενεργότητα και να διερευνήσουμε την αιτία της περιορισμένης αποτελεσματικότητάς της υδροξυουρίας στη β-θαλασσαιμία, καθώς και της ποικίλους ανταπόκρισης των ασθενών στην υδροξυουρία. Σε προσπάθεια εντοπισμού νέων φαρμακευτικών ενώσεων, ογδόντα χημικά ανάλογα γνωστού επαγωγέα της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης, MS-275, προσδιορίστηκαν μέσω μοριακών μοντέλων και χημικών τροποποιήσεων και ελέγχθηκαν για την ικανότητά τους να επάγουν την εμβρυική αιμοσφαιρίνη. Πέντε νέες ενώσεις παρουσίασαν μεγαλύτερη δραστικότητα από το MS-275 όταν ελέγχθηκαν στα K562 ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, γεγονός που επικυρώνει την αποτελεσματικότητα της μεθόδου προσδιορισμού. Δυστυχώς, η δραστικότητα των ενώσεων δεν αναπαράχθηκε ex vivo σε ανθρώπινα ερυθροποιητικά κύτταρα, γεγονός που παροτρύνει για εντοπισμό νέου κυτταρικού μοντέλου για αρχικό έλεγχο φαρμακευτικών ενώσεων. Λαμβάνοντας υπόψη τις αντικαρκινικές ιδιότητες του MS-275, καθώς και τη δραστικότητα ορισμένων αναλόγων να επάγουν ερυθροποιητική διαφοροποίηση των K562 κυττάρων, η αντικαρκινική δραστικότητα δύο χημικών αναλόγων ελέγχθηκε σε διάφορες καρκινικές σειρές. Μεγαλύτερη δραστικότητα παρουσίασαν έναντι των K562 κυττάρων, τα οποία είναι θετικά για το Philadelphia χρωμόσωμα. Θα ήταν, λοιπόν, ενδιαφέρον ο περαιτέρω έλεγχος των αντικαρκινικών ιδιοτήτων τους για τη θεραπεία καρκίνων θετικών για το Philadelphia χρωμόσωμα. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η υδροξυουρία δρα ως χηλικοποιητής και σχηματίζει σύμπλοκα με μεταλλικά ιόντα. Τα σύμπλοκα αυτά αναμένεται να έχουν διαφορετικές χημικές και βιολογικές ιδιότητες και επομένως οι θεραπευτικές ιδιότητες της υδροξυουρίας μπορεί να επηρεαστούν στην παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων των ιόντων αυτών. Ο έλεγχος της επίδρασης διαφόρων μεταλλικών ιόντων (σιδήρου, ψευδάργυρου, χαλκού και αλουμίνιου) στις ιδιότητες της υδροξυουρίας έδειξε ότι μόνο ο σίδηρος επηρέασε όλες τις ιδιότητες της υδροξυουρίας (επίπεδα εμβρυικής και ενήλικης αιμοσφαιρίνης και κυτταρική επιβίωση) που ελέχθησαν σε ερυθροποιητικά κύτταρα. Η επίδραση του σιδήρου στις ιδιότητες της υδροξυουρίας ήταν μεγαλύτερη από τη δική του επίδραση στους πιο πάνω παράγοντες, το οποίο υποδεικνύει είτε ότι ο σίδηρος αντιδρά με την υδροξυουρία μεταβάλλοντας τις ιδιότητές της ή επηρεάζει παράγοντες και μεταγωγικά μόρια που χρησιμοποιεί η υδροξυουρία για να επάγει τις δράσεις της. Η επίδραση του σιδήρου στις ιδιότητες δύο άλλων επαγωγέων της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (MS-275, decitabine) δεν ήταν μεγαλύτερη από τη δική του επίδραση στα επίπεδα εμβρυικής και ενήλικης αιμοσφαιρίνης και κυτταρικής επιβίωσης, υποδεικνύοντας εξειδίκευση για την υδροξυουρία. Είναι, λοιπόν, εμφανές ότι ο σίδηρος επηρεάζει τις θεραπευτικές ιδιότητες της υδροξυουρίας και αυτό εν μέρει δικαιολογεί τη μειωμένη ανταπόκριση στην υδροξυουρία των ασθενών β-θαλασσαιμίας, οι οποίοι έχουν μεγαλύτερα επίπεδα σιδήρου σε σχέση με τους ασθενείς δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Μπορεί, επίσης, να εξηγήσει τη μεγάλη ποικιλία στην ανταπόκριση των ασθενών στην υδροξυουρία μιας και διάφοροι ασθενείς μπορεί να έχουν διαφορετικά επίπεδα σιδήρου.

Beta-thalassaemia is a haemoglobinopathy characterized by reduced or absent β-globin production. Pharmacological reactivation of foetal haemoglobin (HbF) presents an attractive treatment strategy. Despite several HbF inducing agents currently identified none has shown a statisfactory clinical profile and only hydroxyurea (HU) has been FDA approved for the treatment of sickle cell anaemia (SCA). Hydroxyurea, however, exhibits high variability in response amongst patients and has limited use in β-thalassaemia. The objectives of this study were to firstly identify novel HbF inducers with high efficiency and secondly to evaluate the moderate effect of HU in β-thalassaemia patients and the high variability in response to HU treatment. In an effort to identify promising therapeutic agents, 80 chemical analogues of the known HbF inducer, MS-275, were identified via molecular modelling and targeted modification techniques and screened for haemoglobin inducing activity. Five new pharmacological agents exhibited higher activity than MS-275 in the K562 human erythroleukaemia cell line, which confirmed the effectiveness of the identification process. However, the strong activity of the pharmacological agents was not replicated in primary human erythroid cells, which reinforces the necessity for a new cellular system as a first screening tool for potential HbF inducers. Based on MS-275’s anticancer properties and the strong activity of some agents in inducing erythroid differentiation in K562 cells, the anticancer activity of two MS-275 analogues was evaluated in different cancer cell lines. Their effect was greatest in K562 cells which are positive for the Philadelphia chromosome. It would, therefore, be valuable to further evaluate their effect as potential anticancer agents for cancers positive for the Philadelphia chromosome. Recent findings suggest that HU can act as a chelator and form complexes with metal ions. The metal complexes of HU are expected to have altered chemical and biological properties and thus, the therapeutic activities of HU may be affected when high concentrations of such metal ions are present. The evaluation of the effect of different metal ions (iron, zinc, copper and alluminium) on HU’s activities demonstrated that only iron affected all the HU activities (cell survival, HbF and HbA production) tested in primary erythroid cells. Most importantly, the effect of iron on HU’s activities was greater than iron’s own effect on the above parameters, which indicates that either iron interacts with HU and compromises the drug’s activities or affects the factors and signaling molecules that HU regulates to promote these effects. Iron’s effect on the activities of two other HbF inducers (MS-275 and decitabine) was no greater than its own effect on the above parameters, suggesting its specificity for HU. It is, therefore, evident that iron compromises the therapeutic properties of HU and this can partly justify the lower efficacy of HU therapy to the highly iron overloaded β-thalassaemia patients. It can also explain the high variability in response to HU treatment as different patients might have different iron levels. In addition, iron’s and zinc’s own effects on erythroid cell expansion, HbF and HbA production may interfere with the therapeutic activities of HbF inducers in general