Λειτουργικός χαρακτηρισμός της πρωτεϊνης - κινητήρα KIF1Bβ στους νευρώνες

Abstract

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή επιζητεί την ταυτοποίηση και το λειτουργικό χαρακτηρισμό της πρωτεΐνης κινητήρα τύπου κινησίνης, KIF1Bβ του ποντικού. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός της KIF1Bβ με συνδυασμό τεχνικών μοριακής, κυτταρικής βιολογίας, βιοχημείας και γενετικής περιλαμβάνει: την κλωνοποίηση του πλήρους cDNA της KIF1Bβ, την ανάλυση του αναπτυξιακού και τοπικού προτύπου έκφρασης της KIF1Bβ, την περιγραφή του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης σε πρωτογενείς κινητικούς νευρώνες και κυτταρικές σειρές ποντικού και ανθρώπου, την εύρεση αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών της KIF1Bβ και την χαρτογράφηση των αλληλεπιδρόντων πρωτεϊνικών μοτίβων στην KIF1Bβ, καθώς επίσης και την διαλεύκανση και ρύθμιση της βιολογικής λειτουργίας της KIF1Bβ στο πλαίσιο της μετάδοσης σήματος στις νευρωνικές συνάψεις. Η επεξεργασία των συνδυασμένων πειραματικών αποτελεσμάτων έδειξε πως η KIF1Bβ εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε διαφορετικούς ιστούς και κυτταρικούς τύπους και το αναπτυξιακό και τοπικό πρότυπο γονιδιακής έκφρασης της βρίσκεται κάτω από ειδική ρύθμιση τόσο στον άνθρωπο όσο και στο ποντίκι. Η KIF1Bβ, πρωτεΐνη κινητήρας που κινείται προς το θετικό άκρο των μικροσωληνίσκων, βρίσκεται εμπλουτισμένη στη συναπτική περιοχή τόσο στο προ-συναπτικό όσο και στο μετα-συναπτικό κλάσμα απομονωμένων συναπτονευροσωμάτων και εντοπίζεται σε συναπτικά κυστίδια και μετασυναπτικές δομές σε πρωτογενείς κινητικούς νευρώνες. Βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη KIF1Bβ αλληλεπιδρά, μέσω μιας περιοχής που χαρτογραφήσαμε στο καρβοξυτελικό της άκρο, με την πρωτεΐνη-αισθητήρα ασβεστίου καλμοδουλίνη (CaM). Η αλληλεπίδραση αυτή εξαρτάται από την παρουσία ασβεστίου και ότι οι δυο πρωτεΐνες συν-εντοπίζονται ευρέως σε συναπτικές δομές σε καλλιέργειες πρωτογενών κινητικών νευρώνων ποντικού. Η εργασία αυτή αποκάλυψε ότι το mRNA της KIF1Bβ εντοπίζεται στις δενδριτικές βελόνες των συνάψεων, υποδεικνύοντας ότι αυτή η πρωτεΐνη κινητήρας υπόκειται σε τοπική μετάφραση (local translation) και αυτό είναι το πρώτο παράδειγμα πρωτεΐνης-κινητήρα που έχει μέχρι στιγμής αναφερθεί να μεταφράζεται τοπικά στις συνάψεις. Τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης της στον μετα-συναπτικό νευρώνα ρυθμίζονται από τη συναπτική δραστηριότητα και μέσω μονοπατιών μετάδοσης σήματος που εμπλέκεται η πρωτεϊνική κινάση CaMKII. Επιπλέον, φάνηκε ότι η στρατολόγηση της KIF1Bβ στις συνάψεις ρυθμίζεται μέσω μονοπατιών μετάδοσης σήματος των ιοντοτροπικών και μεταβοτροπικών υποδοχέων γλουταμινικού (mGluR1) και συγκεκριμένα η μετάδοση σήματος μέσω των υποδοχέων NMDA διαμορφώνει τα επίπεδα έκφρασης της KIF1Bβ στις προ- και μετα-συναπτικές νευρωνικές απολήξεις. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν ένα αμφίδρομο δίκτυο συναπτικής μετάδοσης σήματος το οποίο δρα προ-συναπτικά και μετα-συναπτικά και εμπλέκει τις πρωτεΐνες KIF1Bβ και CaMKII/CaM στο συντονισμό της λειτουργίας των πρωτεϊνών-κινητήρων, στη συναπτική μεταφορά και τη συναπτική μετάδοση σήματος στους νευρώνες.

This Doctoral Thesis details the functional characterization of kinesin-like motor protein KIF1Bβ (isoform NM015074) from mouse. We used a combined experimental approach to investigate the developmental tissue- and cell-specific expression profile of KIF1Bβ, its intracellular localisation in primary spinal motor neurons and cell lines in mouse and human, the identification of interacting partners of KIF1Bβ and the mapping of KIF1Bβ’s interacting domains. Additionally we provide novel results and contributions towards the elucidation of the biological function and regulation of KIF1Bβ in the context of synaptic signaling in neuronal synapses and in particular insights into its role in the synapses in dendritic spines and its implications in neurodegenerative disease. This work revealed that the expression of KIF1Bβ motor protein, involved in anterograde axonal vesicular transport, is developmentally regulated and enriched in cortical areas in the CNS, including the motor cortex. In neurons we find KIF1Bβ localized to the cell body, axon, and dendrites, overlapping with synaptic-vesicle and postsynaptic-density markers and forming detergent-resistant complexes both in pre- and postsynaptic structures. We demonstrate that KIF1Bβ interacts with calmodulin in a Ca+2-dependent manner through a domain mapped at its carboxyterminal tail. Analyzing purified synaptoneurosomes and primary cultured neurons we conclude that KIF1Bβ is locally translated in dendritic spines and its translation is enhanced by synaptic depolarization, NMDA receptor-dependent signaling, and CaMKII activity. At presynaptic terminals the recruitment of KIF1Bβ is downregulated by retrograde signaling through the NMDA receptor and enhanced by positive feedback via type I metabotropic glutamate receptors (mGluR1 receptors). These results propose a bidirectional synaptic signalling network that appears to act presynaptically and postsynaptically and implicates KIF1Bβ and CaMKII/CaM in the co-ordination of motor protein function, vesicle transport and synaptic signaling.