Reversal of epigenetic ER-β silencing restores sensitivity to tamoxifen in breast cancer cells

Abstract

Όγκοι μαστού οι οποίοι εκφράζουν τους υποδοχείς οιστρογόνου ER-α και ER-β ανταποκρίνονται αποτελεσματικά στις θεραπευτικές και χημειοπροστατευτικές θεραπείες με τη χρήση επιλεκτικών για τους υποδοχείς οιστρογόνου ρυθμιστικών μορίων (Selective Estrogen Receptor Modulators SERMs), όπως η ταμοξιφαίνη (Tamoxifen). Εντούτοις, αρκετοί ασθενείς με καρκίνο του μαστού αναπτύσσουν ανθεκτικότητα στις θεραπευτικές ιδιότητες της ταμοξιφαίνης. Η ανθεκτικότητα μπορεί να είναι de novo ή επίκτητη. Παρά την εντατική έρευνα τις τελευταίες δεκαετίες στο πεδίο αυτό, οι μοριακοί μηχανισμοί οι οποίοι εμπλέκονται στην εμφάνιση της επίκτητης ανθεκτικότητας στην ταμοξιφαίνη παραμένουν άγνωστοι. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε την βασική ΜCF-7 καρκινική μαστού κυτταροσειρά η οποία μετά από εξάμηνη επώαση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ταμοξιφαίνης παρουσίασε επίκτητη ανθεκτικότητα και την μετονομάσαμε σε MCF-7/TAMR. Οι πειραματικές μας προσεγγείσεις απέδειξαν πως ο υποδοχέας οιστρογόνου ER-β στη σειρά αυτή είναι επιγενετικά αποσιωπημένος. Ο ER-β επανεκφράζεται με τη χρήση του αναστολέα της μεθυλίωσης του DNA, 5-aza-deoxycytidine (5-ΑΖΑ), και του αναστολέα της αποακετυλίωσης των ιστονών trichostatin-A (TSA). Ο συνδυασμός των δύο αναστολέων ενίσχυσε περισσότερο το αποτέλεσμα αυτό. Ο σχετικός εμπλουτισμός των κατασταλτικών τροποποιήσεων 2meK9H3, 3meK9H3, 2meK27H3, 3meK27H3 στην περιοχή του υποδοχέα ER-β παρουσιάστηκε σε ψηλά επίπεδα, γεγονός που εξηγεί την αποσιώπηση του γονιδίου. Μετά την επώαση με τους αναστολείς στην περιοχή στρατολογούνται τροποποιήσεις που συσχετίζονται με την ενεργοποίηση της χρωματίνης όπως οι acetylk9H3, 2meK4H3, 3meK4H3 and meK9H3 γεγονός που δικαιολογεί την επανέκφραση του γονιδίου. Προ-επώαση της ανθεκτικής σειράς MCF-7/TAM-R με τους αναστολείς 5-AZA and TSA και ακόλουθη επώαση με τον ενεργό μεταβολίτη 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT), είχε σαν αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με το μη επωασμένο μάρτυρα. Επιπλέον το 4-ΟΗΤ προκάλεσε μετατόπιση του επανεκφρασμένου ER-β στον πυρήνα. Το σύμπλοκο ER-β-ταμοξιφαίνης ενεργοποιεί μεταγραφικά τα γονίδια στόχους pS2 και p21. Ο συνδυασμός 5-AZA/TSA/4-OHT μείωσε επίσης τα κυτταροπλασματικά επίπεδα των HDAC1 και 3. H εξωγενής έκφραση του ER-β η οποία επιτεύχθηκε με την εισαγωγή πλασμιδίου που έφερε το γονίδιο του ER-β είχε σαν αποτέλεσμα την επαναφορά της ευαισθησίας στην ταμοξιφαίνη γεγονός που έχει αποδειχτεί με τον έλεγχος της βιωσιμότητας των κυττάρων και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον εξετάστηκε η επίδραση, τόσο σε επίπεδο mRNA (messenger RNA) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης, της επανέκφρασης του ER-β σε γονίδια που διεξάγουν καθοριστικό ρόλο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (p21) και της απόπτωσης (p53). Η έκφραση των γονιδίων αυτών ενισχύεται σημαντικά παρουσία ταμοξιφαίνης και ER-β γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι ο ER-β κατέχει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στο συγκεκριμένο φάρμακο. Το αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτελεί έρευνα σε περιοχή αιχμής. Μετά την εποχή της γενετικής εισερχόμεθα στην εποχή της επιγενετικής που αποτελεί το θέμα της συγκεκριμένη διατριβής. Οι επιγενετικοί μηχανισμοί άρχισαν να διαφαίνονται πιο σημαντικοί στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων και αναμένεται ότι αυτή η περιοχή της έρευνας θα αποδώσει στο εγγύς μέλλον μελλοντικούς στόχους για σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις στον τομέα του καρκίνου γενικότερα.

Breast adenocarcinomas expressing estrogen receptors ER-α and ER-β are usually responsive to therapeutic and chemopreventive strategies with selective estrogen receptor modulators (SERMs), such as tamoxifen. However, several breast cancers are either genuinely resistant or develop resistance to tamoxifen. Despite findings over the last decades, the molecular mechanisms underlying acquired tamoxifen resistance remain elusive. Using an MCF-7 based breast cancer cell line model for acquired tamoxifen resistance, we show here that ER-β is epigenetically silenced in cells exposed to long-term treatment with tamoxifen. Suppression of ER-β expression was reversed upon treatment by either the demethylating agent 5-aza-deoxycytidine (5-AZA) or the histone deacetylase inhibitor trichostatin-A (TSA) and this synergistic effect was significantly enhanced with combination of the two drugs. Τhe relative enrichment of acetylk9H3, 2meK4H3, 3meK4H3 and meK9H3 is dramatically decreased in all loci of the ER-β promoter, compared with the corresponding loci of the same promoter in the parental cell line (MCF-7). The relative enrichment of histone modifications associated with chromatin folding (2meK9H3, 3meK9H3, 2meK27H3, 3meK27H3) were higher in MCF-7/TAMR in the promoter of ER-β cells compared to the parental cells. However, in the promoter of ER-β this same treatment resulted in the recruitment of modifications that are known to promote active transcrption. Interestingly, pre-treatment of tamoxifen resistant (MCF-7/TAM-R) cells with 5-AZA and TSA followed by 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT) treatment significantly decreased cell viability compared to the mock treated group. Furthermore, tamoxifen induced nuclear translocation of the re-expressed ER-β and transcriptional activation of its known target genes pS2 and p21, indicating that the receptor is functional. Importantly, transfection of MCF-7/TAM-R cells with an ER-β expression vector, sensitized cells to the growth inhibitory and pro-apoptotic effects of 4-OHT, indicating that ER-β re-expression is sufficient to restore sensitivity to tamoxifen. This effect was associated with increased p53 and p21 protein levels, suggesting that ER-β-induced sensitisation to tamoxifen is mediated via this pathway. The combination 5-AZA and TSA reduces significantly the levels of HDAC3. However, when the cells were following treated with 10 μΜ of 4-OHT for 24 hours we observed a substantial increase in HDAC1 and HDAC3 protein levels. Surprisingly, when the combination treatment of 5-AZA/TSA/4-OHT was applied, the levels of HDAC1, HDAC3 were diminished. Using Kaplan Meier analysis, we demonstrated that women with breast cancer expressing high levels of ER-β, when treated with any endocrine therapy (i.e. tamoxifen, raloxifen or aromatase inhibitors) and any chemotherapy show a better prognostic survival than those with lower ER-β levels. Our novel findings reveal that ER-β is critical in overcoming tamoxifen resistance, and this could be applied in the design of new drugs or in protocols for treating acquired tamoxifen resistance.