Η γενετική διερεύνηση των νεφροπαθειών κολλαγόνου IV στον πληθυσμό Κύπρου και Ελλάδας με συμβατικές προσεγγίσεις και με αλληλούχηση επόμενης γενεάς

Abstract

Η Οικογενής Μικροσκοπική Αιματουρία (ΟΜΑ) αποτελεί μία γενετικά ετερογενή ομάδα παθήσεων που συμπεριλαμβάνουν κληρονομικές σπειραματοπάθειες, όπως το σύνδρομο Alport και τη Νεφροπάθεια της Λεπτής Βασικής Μεμβράνης (ΝΛΒΜ). Το φυλοσύνδετο σύνδρομο Alport είναι μία σπάνια ασθένεια, η οποία οφείλεται σε μεταλλάξεις στο γονίδιο COL4A5 (85%). Ακόμη πιο σπάνιο είναι το αυτοσωματικό υπολειπόμενο σύνδρομο Alport (15%) που οφείλεται σε μεταλλάξεις (σε ομοζυγία ή σε σύνθετη ετεροζυγωτία) στα γονίδια COL4A3 ή COL4A4. Αντίθετα, η ΝΛΒΜ εμφανίζεται πιο συχνά στον πληθυσμό, με συχνότητα περίπου 1% και προκύπτει μετά από εκδήλωση σε ετεροζυγωτία μίας μετάλλαξης, είτε στο COL4A3, είτε στο COL4A4. Η παρούσα διατριβή έχει επικεντρωθεί στη διερεύνηση εμπλοκής κυρίως του γονιδίου COL4A3 του κολλαγόνου τύπου IV της Σπειραματικής Βασικής Μεμβράνης (ΣΒΜ), μεταλλάξεις στο οποίο οδηγούν σε ΟΜΑ. Για την πραγματοποίηση της μελέτης αυτής έγινε συλλογή δειγμάτων από ελλαδικές και κυπριακές οικογένειες, με στόχο την κλινική και μοριακή διάγνωση. Απώτερος σκοπός της συλλογής αυτής είναι η προσφορά προσυμπτωματικής διάγνωσης όπου ενδείκνυται, επιβεβαίωση διάγνωσης, πρόγνωσης και πρόληψης, μέσω μελέτης και τεκμηρίωσης του γενετικού λάθους. Φαινότυποι και διαγνώσεις που αφορούν στο παρόν ερευνητικό έργο περιλαμβάνουν τις βασικότερες νόσους που έχουν συσχετιστεί με μικροσκοπική αιματουρία σπειραματικής προέλευσης, τη ΝΛΒΜ και το αυτοσωματικό υπολειπόμενο σύνδρομο Alport. Η μελέτη του φυλοσύνδετου συνδρόμου Alport έχει διεκπεραιωθεί σε προηγούμενο ερευνητικό έργο. Σκοπός είναι, επίσης, η καλύτερη κατανόηση της φαινοτυπικής ετερογένειας των νοσημάτων αυτών και ο συσχετισμός γονότυπου-φαινότυπου. Στο πλαίσιο μελέτης συσχέτισης του γονιδίου COL4A3 με την μικροσκοπική αιματουρία επιλέχθησαν ασθενείς από 57 ελληνοκυπριακές οικογένειες και ασθενείς από 24 κρητικές οικογένειες. Κύριο κριτήριο για να συμπεριληφθεί μία οικογένεια στην μελέτη μας ήταν η παρουσία τουλάχιστον 3 ατόμων ασθενών με μικροσκοπική αιματουρία. Όσον αφορά στις Ελληνοκυπριακές οικογένειες έχουν βρεθεί συνολικά 8 μεταλλάξεις στα γονίδια (COL4A3/A4), ποσοστό 28.1%. Βιοψίες από 8 ασθενείς με ΝΛΒΜ έδειξαν και ιστοπαθολογικά ευρήματα Εστιακής Τμηματικής Σπειραματοσκλήρυνσης (ΕΤΣΣ). Σε δέκα ασθενείς που κατέληξαν σε Τελικού Σταδίου Νεφρική Ανεπάρκεια (ΤΣΝA) και στους οποίους είχε βρεθεί μόνο μία μετάλλαξη στα κολλαγόνα, προχωρήσαμε σε περαιτέρω ανάλυση του γενετικού τους υλικού με την αλληλούχηση επόμενης γενεάς (Next Generation Sequencing). Παρόλα αυτά, δεν ταυτοποιήθηκε κάποια καινούρια μετάλλαξη. Επιπροσθέτως, στις 24 κρητικές οικογένειες έχουν βρεθεί 17 μεταλλάξεις σε 17 οικογένειες, ποσοστό 71%. Η μελέτη των οικογενειών αυτών έχει γίνει κυρίως με αλληλούχηση επόμενης γενεάς και στο συγκεκριμένο πάνελ υπήρχε και το γονίδιο COL4A5. Μετά την ολοκλήρωση των πειραμάτων σε γενετικό επίπεδο ακολούθησε μελέτη των ευρεθέντων μεταλλάξεων σε κυτταρικό επίπεδο. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε ποδοκυτταρικές σειρές AB8/13, με παροδική επιμόλυνση μίας μεταλλαγμένης αλυσίδας του κολλαγόνου COL4A3 ή COL4A4. Παράλληλα, υπήρχαν και οι κατάλληλες κυτταροσειρές μάρτυρες, οι οποίες είχαν επιμολυνθεί με πλασμιδιακούς φορείς που εξέφραζαν τις φυσιολογικές αλυσίδες. Η μελέτη επιρροής των μεταλλάξεων στην έκφραση και έκκριση των εκάστοτε αλυσίδων μελετήθηκε με πειράματα αποτύπωσης κατά Western. Στη συνέχεια, έγινε υπερέκφραση φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλυσίδων σε ποδοκύτταρα για διαλεύκανση του ρόλου του μηχανισμού «Απόκρισης Αδίπλωτων Πρωτεϊνών» (Unfolded Protein Response). Μία από τις βασικές λειτουργίες του Ενδοπλασματικού Δικτύου (ΕΔ) που διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στη σωστή λειτουργία του οργανισμού και στην ομοιόστασή του είναι η ορθή αναδίπλωση και ωρίμανση των πρωτεϊνών που προορίζονται για έκκριση στον εξωκυττάριο χώρο. Η τύχη των πρωτεϊνών που δεν διπλώνονται ορθά είναι να παραμένουν στο ΕΔ και να συνδέονται με την πρωτεΐνη BiP, η οποία είναι συνδεδεμένη με διαμεμβρανικούς αισθητήρες στρες του ΕΔ υπό κανονικές συνθήκες. Όταν μία μη ορθά αναδιπλωμένη πρωτεΐνη συνδεθεί με την πρωτεΐνη BiP, ελευθερώνονται οι αισθητήρες αυτοί και ο καθένας ενεργοποιεί ένα ξεχωριστό μοριακό μονοπάτι. Έτσι, ελέχθησαν κάποιοι σημαντικοί αισθητήρες στρες του ΕΔ με ένδειξη στατιστικά σημαντικού στρες σε κυτταροσειρές, επιμολυσμένες με συγκεκριμένες μεταλλαγμένες αλυσίδες. Παράλληλα, έγινε προσθήκη χημικών μορίων που συμπεριφέρονταν ως chaperones σε ποδοκύτταρα που εξέφραζαν τόσο τις άγριου τύπου αλυσίδες, όσο και τις μεταλλαγμένες αλυσίδες. Σε μία πρώτη σειρά πειραμάτων παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη και στατιστικά σημαντική έκκριση εκτός του κυττάρου των μεταλλαγμένων αλυσίδων, τις οποίες προφανώς βοήθησαν να αναδιπλωθούν ορθά οι χημικές chaperones.