Selective activation of TNFR1 and NF-kB inhibition by a novel biyouyanagin analogue promotes apoptosis in acute leukemia cells

Abstract

Το KC-53 είναι ένα νεοσυντιθέμενο biyouyanagin ανάλογο μόριο με γνωστή ισχυρή αντιφλεγμονώδη και αντιική δράση. Στην παρούσα εργασία, διερευνήσαμε την αντιπολλαπλασιαστική του δράση σε 13 αντιπροσωπευτικές ανθρώπινες καρκινικές σειρές, σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) καθώς επίσης και σε αθανατοποιημένα κύτταρα. Με τη χρήση αναλυτικών και ποσοτικών τεχνικών αποκαλύψαμε μεθοδικά το μοριακό μηχανισμό δράσης του στις δύο λευχαιμικές σειρές, HL-60 (APL) και CCRF/CEM (ALL), οι οποίες παρουσίασαν τη μεγαλύτερη ευαισθησία στη δράση του μορίου. Η ουσία KC-53 προκάλεσε άμεσα και μη αναστρέψιμα επαγωγή της απόπτωσης και στις δυο κυτταρικές σειρές σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις (με IC50 ~2.3 μM). Η απόπτωση χαρακτηρίστηκε από αύξηση των μεμβρανικών επιπέδων του υποδοχέα του παράγοντα νέκρωσης όγκων, TNFR1, ενεργοποίηση της κασπάσης 8 και πρωτεολυτική απενεργοποίηση της κινάσης RIP1 υποδηλώνοντας ότι, το KC-53 επάγει την ενεργοποίηση του εξωγενούς μονοπατιού της απόπτωσης. Επιπροσθέτως, το KC-53 προκάλεσε την επαγωγή του ενδογενούς μονοπατιού της απόπτωσης μέσα από την ενεργοποίηση της κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης Bid, της κασπάσης 9 και της μετατόπισης του παράγοντα επαγωγής της απόπτωσης, AIF από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα. Η καταστολή της έκφρασης του πρωτεϊνικού μορίου FADD στις σειρές HL-60 και CCRF/CEM, προκάλεσε την ανθεκτικότητα των σειρών έναντι της αντιπολλαπλασιαστικής δράσης του KC-53 και ανέστειλε πλήρως την αποπτωτική του δράση. Επιπροσθέτως, η χορήγηση του KC-53 παρεμπόδισε τη δράση του παράγοντα νέκρωσης όγκων, TNFα καταστέλλοντας συγκεκριμένα τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης, TRAF2 και του αναστολέα του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, IκBα. Σαν αποτέλεσμα, ο NF-κΒ παραμένει προσδεδεμένος με τον αναστολέα του στο κυτταρόπλασμα και αδυνατεί να μετακινηθεί εντός του πυρήνα. Αυτό υποστηρίζεται και από την παρατηρούμενη μείωση των επιπέδων έκφρασης διαφόρων γονιδίων στόχων του NF-κΒ μετά από χορήγηση του KC-53. Συγκεντρωτικά, τα πειραματικά μας δεδομένα, παρουσιάζουν για πρώτη φορά, τις αντικαρκινικές ιδιότητες του KC-53 μορίου και παρέχουν λεπτομερή περιγραφή του μοριακού μηχανισμού δράση του. Τα δεδομένα αυτά θα μπορούσαν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν στο σχεδιασμό νέων στοχευμένων θεραπειών για την καταπολέμηση συγκεκριμένων μορφών λευχαιμίας

KC-53 is a novel biyouyanagin analogue with anti-inflammatory and anti-viral activity. Here, we examined the anti-proliferative effects of KC-53 in 13 representative human cancer cell lines, in normal peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and in immortalized cells. With detailed molecular probing we unraveled its molecular mode of action in the two most sensitive cell lines; HL-60 and CCRF/CEM. The novel agent promoted rapidly and irreversibly apoptosis in both leukemic cell lines at relatively low concentrations (with an IC50 of ~2.3 μM). Apoptosis was characterized by an increase in membrane-associated TNFR1, activation of Caspase-8 and proteolytic inactivation of the death domain kinase RIP1 indicating that the KC-53 induced mainly the extrinsic/death receptor apoptotic pathway. Induction of the intrinsic/mitochondrial pathway was also achieved by Caspase-8 processing of Bid, activation of Caspase-9 and increased translocation of AIF to the nucleus. FADD protein knockdown restored HL-60 and CCRF/CEM cell viability and completely blocked KC-53-induced apoptosis. These data advocate the close correlation between the FADD/Caspase-8/RIP1 signaling axis and apoptotic effects of KC-53, which suggests being through activation of the TNFR1 death receptor initiated events. Furthermore, KC-53 administration dramatically inhibited TNFα-induced serine phosphorylation on TRAF2 and on IκBα, stabilizing the cytosolic IκBα-p65/NF-κΒ and hindering p65 translocation to the nucleus. Reduced transcriptional expression of pro-inflammatory and pro-survival target genes, confirmed that the agent functionally inhibited the transcriptional activity of p65. Our findings demonstrate, for the first time, the selective anticancer properties of KC-53 towards leukemic cell lines and provide a detailed understanding of the molecular events underlying its dual anti-proliferative and pro-apoptotic properties. These findings are likely to provide new insights into the development of innovative death receptor-targeted therapies for the treatment of acute leukemia.