Molecular genetic investigation, epidemiology and genotype-phenotype correlation in familial microscopic hematuria

Abstract

Η παρούσα διατριβή έχει επικεντρωθεί στη διερεύνηση εμπλοκής γνωστών γονιδίων του κολλαγόνου τύπου IV της βασικής μεμβράνης του σπειράματος (COL4A4, COL4A5) καθώς και στην έρευνα για νέα γονίδια που συνδέονται με Οικογενή Μικροσκοπική Αιματουρία. Βασικός στόχος αποτέλεσε η κλινική και μοριακή διερεύνηση οικογενειών από Κυπριακό και Ελλαδικό χώρο, με απώτερο σκοπό την προσφορά προσυμπτωματικής διάγνωσης όπου ενδείκνυται, επιβεβαίωση διάγνωσης, πρόγνωσης και πρόληψης, μέσω τεκμηρίωσης του γενετικού λάθους. Φαινότυποι και διαγνώσεις που αφορούν το παρόν ερευνητικό έργο περιλαμβάνουν τις βασικότερες νόσους που έχουν συσχετιστεί με μικροσκοπική αιματουρία σπειραματικής προέλευσης, την Νεφροπάθεια των Λεπτών Βασικών Μεμβρανών (ΝΛΒΜ) και το Σύνδρομο Alport (φυλοσύνδετο και αυτοσωμικό). Για την ταυτοποίηση μεταλλαγών στο COL4A5, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του γονιδίου αυτού σε εννέα οικογένειες (από Κυπριακό και Ελλαδικό χώρο), που πληρούσαν προϋποθέσεις για Σύνδρομο Alport φυλοσύνδετης κληρονόμησης. Στo πλαίσιο μελέτης συσχέτισης του γονιδίου COL4A4 με την μικροσκοπική αιματουρία, επιλέχθηκαν 123 ασθενείς εκ των οποίων περιλαμβάνονται τόσο περιπτώσεις οικογενούς κληρονόμησης, όσο και σποραδικές. Επιπρόσθετος στόχος της παρούσης ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε και ταυτοποίηση γενετικών τροποποιητικών παραγόντων που ευθύνονται για την ύπαρξη ήπιας και σοβαρότερης μορφής οικογενούς μικροσκοπικής αιματουρίας. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε με βάση προηγούμενων ευρημάτων στα γονίδια MYH9 και APOL1. Ανάμεσα σε 42 ασθενείς με υποψία για Σύνδρομο Alport φυλοσύνδετης κληρονόμησης, έχουν ταυτοποιηθεί τέσσερις μεταλλάξεις (E228X, 2946delT, G624D and P628L). Φορείς των δύο αντικαταστάσεων παρουσιάζουν ηπιότερο φαινότυπο (μικροσκοπική αιματουρία με ή χωρίς πρωτεϊνουρία), ως αποτέλεσμα ΝΛΒΜ. Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο και με αποτελέσματα άλλων ερευνητικών ομάδων. Κατά την σάρωση του γονιδίου COL4A4, έχουν ταυτοποιηθεί εφτά συνολικά μεταλλάξεις (L30F, G143V, G208D, G748S, G774S, G1015E, g. 70540del52bp). Αξίζει να σημειωθεί ότι το 23% των ανδρών και 14.3% των γυναικών φορέων COL4A4 μετάλλαξης προοδεύουν σε Χρόνια Νεφρική Νόσο και Νεφρική Νόσο Τελικού Σταδίου, επιβεβαιώνοντας προηγούμενα ευρήματα. Εν κατακλείδι, η διερεύνηση ταυτοποίησης γενετικών τροποποιητικών παραγόντων έδειξε συσχέτιση rs11089788-MYH9 με αυξανόμενο κίνδυνο για αρνητική εξέλιξη της νόσου σε νεφρική ανεπάρκεια.

Familial microscopic hematuria (MH) of glomerular origin represents a heterogeneous group of monogenic conditions, involving several genes, some of which remain unknown. Three collagen IV genes, COL4A3, COL4A4 and COL4A5 explain the autosomal and X-linked forms of Alport Syndrome (ATS), as well as Thin Basement Membrane Nephropathy (TBMN). A number of X-linked ATS patients follow a milder course reminiscent of that of patients with heterozygous COL4A3/COL4A4 mutations and TBMN, while at the same time a significant subset of patients with TBMN and familial microscopic hematuria progress to chronic kidney disease or end-stage kidney disease. The present study was based on the hypothesis according to which many families or sporadic cases of microscopic hematuria, combined or not with renal failure, may be explained by COL4A3, COL4A4 or COL4A5 mutations. Firstly, DNA analysis using haplotype construction was performed for Xq22-23 (COL4A5) and 2q36-37 (COL4A3/COL4A4) loci was performed, followed by screening and identification of relevant causative mutations in these genes. In addition, this work was aiming to genotype-phenotype correlation of X-linked ATS patients, as well as to the identification of modifier genetic factors responsible for the existence of mild and severe cases of familial hematuria. We based our decision solely on the strength on previous genetic associations implicating MYH9 and APOL1 genes. Among 42 patients of nine Hellenic families suspected to have X-linked Alport syndrome, eleven nucleotide variants were identified, four of which are causative mutations (E228X, 2946delT, G624D and P628L). The findings in families segregating mutations G624D and P628L are indicative of less severe phenotypes, stretching the phenotypic expression to only microhematuria with or without proteinuria, as a result of TBMN. This observation is confirmed by several investigators. During screening of COL4A4 gene seven mutations (L30F, G143V, G208D, G748S, G774S, G1015E, g. 70540del52bp) were detected as well as numerous SNPs. Interestingly, the percentage of the individuals progressing either to CKD or ESKD, reaches 23% for male and 14.3% for female mutation carriers. Recent data on a large Cypriot cohort confirm that not all TBMN cases will follow a benign course and regular annual check-ups, including tests for proteinuria, should alert patients and physicians to the possibility of progression into CKD and eventually ESKD. A renal biopsy should be seriously considered at this stage and appropriate measures should be taken to arrest the progression of the disease. Finally, experimentations for modifier genetic factor investigation showed significance only for rs11089788-MYH9. The finding that rs11089788 is important and critical in increasing the risk for proteinuria and progressive renal failure on the background of a primary monogenic glomerulopathy may prove useful regarding early and effective interventions. However, it remains unclear how certain non-coding MYH9 variants are associated with renal failure in multiple populations and nephropathies.