In vitro investigation of the role of Ras Suppressor-1 (RSU-1) and Integrin-Linked kinase (ILK) in glioma progression and invasion

Abstract

Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (Glioblastoma multiforme-GBM) είναι ο πιο επιθετικός τύπος καρκίνου του εγκεφάλου λόγω της ικανότητας των κυττάρων του να διεισδύουν σε γειτονικούς ιστούς. H μέση επιβίωση για τους ασθενείς είναι 15 μήνες καθιστώντας επιτακτική την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών στόχων. H πρωτεΐνη Ras Suppressor-1 (RSU-1) αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Particularly interesting new cysteine-histidine rich (PINCH1) που με τη σειρά της είναι συνδεδεμένη με την Integrin Linked Kinase (ILK) και την α-parvin (PARVA) σχηματίζοντας ένα σταθερό σύμπλοκο στις εστιακές προσκολλήσεις, συνδέσεις μεταξύ κυττάρου και εξωκυττάριας μήτρας (Extracellular matrix-ECM). Πρόσφατα, η RSU-1 αποδείχτηκε ότι εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε δείγματα μεταστατικού καρκίνου του μαστού ενώ βρέθηκε ότι προάγει τη διεισδυτική ικανότητα καρκινικών κυττάρων ρυθμίζοντας τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Ο αυξητικός παράγοντας διαφοροποίησης-15 (Growth Differentiation Factor 15-GDF15) είναι επίσης γνωστό ότι εμπλέκεται στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης και στη μετάσταση. O στόχος της παρούσας έρευνας ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των πρωτεϊνών RSU-1 και ILK στην επιθετικότητα των κυττάρων του γλοιώματος. Aρχικά, τέσσερις κυτταρικές σειρές γλοιώματος χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: στις περισσότερο επιθετικές (Α172 και U87-MG) και στις λιγότερο επιθετικές (Η4 και SW088). H RSU-1 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στα πιο επιθετικά κύτταρα γλοιόματος. Επιπλέον, η αποσιώπηση της RSU-1 είχε αντίθετο αποτέλεσμα ως προς τη διήθηση των κυττάρων του γλοιόματος αναστέλλοντας τη διήθηση των επιθετικών κυττάρων και προάγοντας εκείνη των λιγότερο επιθετικών κυττάρων μέσω της ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6) και της μεταλλοπρωτεϊνάσης 13 (MMP13). Στη συνέχεια, παρατηρήθηκε ότι στις υπό μελέτη κυτταρικές σειρές η αυξημένη διηθητική ικανότητα συσχετιζόταν με αυξημένα επίπεδα έκφρασης RSU-1 και μειωμένα επίπεδα έκφρασης GDF15. Έτσι, το επόμενο ερώτημα ήταν αν υπάρχει κάποιου είδους συσχέτιση μεταξύ της RSU-1 και της πρωτεΐνης GDF15 όσον αφορά τη διεισδυτικότητα των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η διαφορετική έκφραση των πρωτεϊνών RSU-1 και GDF15 οδηγεί σε αναστολή της κυτταρικής διεισδυτικότητας στα λιγότερο επιθετικά Η4 κύτταρα και προαγωγή στα περισσότερο επιθετικά Α172 μέσω αλλαγών στην έκφραση των PINCH1, RhoA και ΜΜΡ13. Η ILK έχει επίσης αποδειχθεί ότι προάγει τη διεισδυτικότητα στο GBM, ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον εμπλεκόμενο μοριακό μηχανισμό. Έτσι, ο στόχος μας ήταν να μελετήσουμε την επίδραση της αποσιώπησης του γονιδίου ILK στη διηθητική συμπεριφορά των κυττάρων γλοιοβλαστώματος και να διασαφηνίσουμε τον εμπλεκόμενο μοριακό μηχανισμό χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά Η4 και την κυτταρική σειρά Α172 που εκφράζει επίσης την πρωτεΐνη ILK σε πολύ υψηλότερα επίπεδα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αποσιώπηση του γονιδίου ILK αναστέλλει τη διήθηση των άκρως διεισδυτικών κυττάρων Α172, ενώ δεν επηρεάζει την ικανότητα μετακίνησης των κυττάρων Η4. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίχθηκαν από αντίστοιχες μεταβολές στην έκφραση της σχετιζόμενης με Rho κινάσης -1 (ROCK-1), και των γονιδίων Fascin-1 καθώς και της μεταλλοπρωτεϊνάσης ΜΜΡ13. Η παρούσα διατριβή έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης των RSU-1, GDF15 και ILK επηρεάζουν τη διηθητκή ικανότητα των κυττάρων των γλοιωμάτων, θέτοντας τις πρωτεΐνες αυτές ως στόχους για την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων και για την αντιμετώπιση ενός από τους πιο επιθετικούς τύπους όγκων του εγκεφάλου.

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive type of malignant brain tumours due to its highly invasive phenotype. The average survival for patients with GBM is 15 months, making the discovery of novel invasion biomarkers and therapeutic targets imperative. Ras Suppressor-1 (RSU-1) is a cell-Extracellular matrix (ECM) adhesion protein that interacts with Particularly interesting new cysteine-histidine rich protein (PINCH-1), which is being connected to Integrin Linked Kinase (ILK) and alpha-parvin (PARVA). Recently, RSU-1 was shown to be up-regulated in metastatic breast cancer samples and was found to promote the invasive capacity of cancer cells by regulating the actin cytoskeleton remodeling-related proteins. Growth differentiation factor-15 (GDF15) is also known to be involved in actin cytoskeleton reorganization and metastasis. Taking into consideration the above, the aim of this thesis was to investigate the role of RSU-1 and ILK in glioma cell aggressiveness. For this purpose, firstly, four brain cell lines were divided into two distinct groups: highly invasive glioblastoma cell lines (A172 and U87-MG) and less invasive cells (H4 and SW088). Interestingly, we found that RSU-1 was significantly upregulated in more aggressive glioma cells compared to less aggressive. Moreover, RSU-1 silencing had opposing effects on glioma cell invasion depending on their aggressiveness, inhibiting migration and invasion of aggressive cells and promoting those of less aggressive cells through regulation of Signal Transducer and Activator of Transcription6 (STAT6) phosphorylation and Matrix Metalloproteinase13 (MMP13) expression. We also observed that the investigated cell lines (H4 and A172) had increasing RSU-1 expression levels and invasive capacity and decreasing GDF15 levels. Thus, the next question was whether there is any kind of interplay between RSU-1 and GDF15 with regard to glioblastoma cell invasion. Our results showed that the differential expression of RSU-1 and GDF15 in H4 and A172 cells lead to inhibition of cell invasion in H4 cells and promotion in A172 through respective changes in PINCH1, RhoA and MMP-13 expression. Regarding ILK in GBM aggressiveness little is known. Thus, the aim of the present work was to study the effect of ILK silencing on the metastatic behavior of glioblastoma cells in vitro and elucidate the underlying molecular mechanism using the neuroglioma H4 cell line and the GBM A172 cells, which also express ILK in much higher levels. My results showed that siRNA-mediated silencing of ILK inhibits cell migration and invasion of the highly invasive A172 cells while it does not seem to affect the motility capacity of H4 cells. These data were also supported by respective changes in the expression of Rho-associated kinase -1 (ROCK-1), Fascin-1 and MMP13. Finally, findings were corroborated further by an analysis of The Cancer Genome Atlas Glioblastoma Multiforme (TCGA-GBM) dataset. In the present work it was clearly shown that RSU-1, GDF15 and ILK expression affects the in vitro metastatic properties of glioma/glioblastoma cells, setting the grounds for examining these molecules as potential target-molecules in the development of novel anti-metastatic therapeutic approaches for dealing with one of the most aggressive types of malignant brain tumors.