Multi-bacteria, multi-antibiotic, testing using Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) for Urinary Tract Infection (UTI) diagnosis / Katerina Hadjigeorgiou

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η ανάπτυξη μίας γρήγορης και αξιόπιστης μεθόδου, βασισμένης στην Ενισχυμένη Φασματοσκοπία Ράμαν, η οποία (i) θα προσδιορίζει αν ένα δείγμα είναι “θετικό” ή “αρνητικό” για ουρολοίμωξη, (ii) θα κατηγοριοποιεί τα βακτήρια που βρίσκονται στο “θετικό δείγμα” ανάλογα με το είδος τους, και (iii) θα καθορίζει την ευαισθησία των βακτηρίων σε διάφορα αντιβιοτικά, σε σύντομο χρονικό διάστημα. Θα παρέχει επίσης την ικανότητα κατηγοριοποίησης των βακτηρίων που προέρχονται απευθείας από δείγματα ούρων, ανάλογα με το είδος τους. Η ουρολοίμωξη είναι μια βακτηριακή λοίμωξη που εντοπίζεται οπουδήποτε στο ουροποιητικό σύστημα και είναι ένας από τους πιο συνήθεις τύπους λοιμώξεων. Επηρεάζει περισσότερο από το 50% των γυναικών παγκοσμίως, χρόνιους ασθενείς και παιδιά κάτω των δύο ετών. Οι παρούσες μέθοδοι διάγνωσης απαιτούν 24 ώρες για την ταυτοποίηση των βακτηρίων που προκαλούν τις ουρολοιμώξεις, όπως επίσης ακόμα 24 ώρες για τον καθορισμό του πιο αποτελεσματικού αντιβιοτικού. Αυτές οι συμβατικές μέθοδοι διάγνωσης είναι χρονοβόρες, με αποτέλεσμα οι γιατροί να συνταγογραφούν ένα αντιβιοτικό ευρέος φάσματος μέχρι να γνωστοποιηθούν τα επίσημα αποτελέσματα της διάγνωσης. Αναπόφευκτα, η χρήση μη βέλτιστων, ως προς το είδος της ουρολοίμωξης, αντιβιοτικών οδηγεί σε αναποτελεσματικές θεραπείες, επανερχόμενες λοιμώξεις, αυξημένο οικονομικό κόστος και ευθύνεται για ανάπτυξη αντίστασης των βακτηρίων στα αντιβιοτικά. Ως εκ τούτου μία μέθοδος που θα μειώσει κατά πολύ τον χρόνο που χρειάζεται για τη διάγνωση ουρολοίμωξης και την δημιουργία αντιβιογράμματος, θα είχε σημαντικά οφέλη στη διαχείριση των ουρολοιμόξεων.Η βάση αυτής της πειραματικής μελέτης είναι η Φασματοσκοπία Ράμαν. Η φασματοσκοπία Ράμαν είναι μια οπτική τεχνική η οποία χρησιμοποιεί μονοχρωματική δέσμη φωτός (λέιζερ) και συλλέγει φάσματα τα οποία περιέχουν κορυφές που αντιστοιχούν στη χημική σύνθεση και τη μοριακή δομή μίας ουσίας. Αυτή η πληροφορία είναι μοναδική και χαρακτηριστική για κάθε δείγμα. Για να αυξηθεί η ένταση του σήματος Ράμαν, μεταλλικά νανοσωματίδια προστίθενται στο δείγμα. Αυτή η τεχνική ονομάζεται Ενισχυμένη Φασματοσκοπία Ράμαν. Για αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν πέντε είδη βακτηρίων Citrobacter, Proteus, Klebsiella sp., Escherichia coli και Enterobacteur και συλλέχθηκαν από ασθενείς με ουρολοίμωξη. Επιπρόσθετα, για τον καθορισμό της ευαισθησίας των βακτηρίων, εξετάστηκαν οκτώ αντιβιοτικά που έχουν διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης όπως amoxil, augmentin, cefuroxime, ciprofloxin.Η επεξεργασία των δεδομένων έγινε με αλγόριθμους που αναπτύχθηκαν στη MATLAB και αποτελείται από τα ακόλουθα στάδια: (i) προεπεξεργασία δεδομένων για αφαίρεση θορύβου, (ii) δημιουργία feature vector, (iii) εφαρμογή Principal Component Analysis για μείωση διαστάσεων δεδομέων, (iv) κατηγοριοποίηση χρησιμοποιώντας Linear Discriminant Analysis, (v) αξιολόγηση αποτελεσμάτων μέσω Leave-One Out Cross Validation, (iv) εφαρμογή MANOVA για οπτικοποίηση αποτελεσμάτων. Τα αποτελέσματα αυτού του ερευνητικού έργου είναι πολύ ελπιδοφόρα. Χρησιμοποιώντας Ενισχυμένη Φασματοσκοπία Ράμαν είναι δυνατό (i) να εντοπιστεί η συγκέντρωση βακτηρίων σε κάθε δείγμα, σε συγκεντρώσεις ακόμα και 103 βακτήρια/ml, και να καθοριστεί η παρουσία ουρολοίμωξης, (ii) να κατηγοριοποιηθεί σωστά το είδος των βακτηρίων με ακρίβεια 93.75%, και (iii) να ταυτοποιηθεί η ευαισθησία στα αντιβιοτικά μέσα σε 2 ως 4 ώρες έκθεσης, με ακρίβεια 81.25 ως 100%. Αυτά τα προκαταρκτικά αποτελέσματα θα μπορούσαν να αποτελέσουν σημείο αφετηρίας για ανάπτυξη ενός καινοτόμου εργαλείου, το οποίο θα παρέχει διάγνωση και αντιβιόγραμμα ουρολοίμωξης εντός της ίδιας μέρας, επιτρέποντας πιο αποτελεσματική θεραπεία.

The aim of this research was to develop of a fast and accurate method, based on Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), that could (i) detect if a sample is “positive” or “negative” for a Urinary Tract Infection (UTI); (ii) classify the causative bacteria, found in the “positive sample”, according to their species; and (iii) determine bacterial susceptibility to various antibiotics in a short period of time. It should also allow correct classification of bacterial species coming directly from urine samples. UTI is a bacterial infection, anywhere in the urinary tract, and is one of the most common types of infections. More than 50% of women globally will develop UTIs in their lifetime. Also, vulnerable το UTIs are chronically ill patients and children younger than two years old. Current diagnostic methods require 24 hours for the identification of the causative bacteria as well as another 24 hours for the determination of the most effective antibiotic. These conventional diagnostic methods are time consuming and lead doctors to prescribe broad spectrum antibiotics until the official results of the diagnosis are known. These actions inevitably lead to ineffective treatments, recurrent infections, significant burden to national healthcare systems and is responsible for antibiotic resistance. A method that will reduce the time needed for UTI diagnosis and antibiogram could significantly benefit the management of UTIs.This experimental study will be based on Raman Spectroscopy. Raman Spectroscopy is an optical technique that utilizes a monochromatic laser source to collect spectra that contain peaks corresponding to the chemical composition and the molecular structure of a substance. This information is unique and characteristic for any sample. In order to increase the intensity of the Raman signal, metal nanoparticles are introduced in the sample. This technique is called Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS). Furthermore, for this study five bacteria such as Citrobacter, Proteus, Klebsiella sp., Escherichia coli and Enterobacteur were collected from patients with UTI. Additionally, for determining bacterial susceptibility antibiotics such as amoxil, augmentin, cefuroxime and ciprofloxacin were examined.The data were processed using algorithms developed in MATLAB. The steps that were followed are: (i) data preprocessing for noise removal, (ii) creation of feature vectors, (iii) implementation of Principal Component Analysis (PCA) to reduce data dimensionality, (iv) classification of the data utilizing Linear Discriminant Analysis, (v) evaluation of the method using Leave-One Out Cross Validation (LOOCV), (vi) visualization of the results using MANOVA.The results of this research project are very promising. They provide a clear indication that, utilizing SERS, it is feasible to (i) detect the concentration of bacteria per sample, down to levels of 103 bacteria/ml, and determine the presence of a UTI; (ii) classify correctly the bacterial species with an acuracy of 93.75%; and (iii) identify antibiotic susceptibility within two to four hours of exposure with correct classification ranging from 81.25 to 100%. These preliminary results can serve as the starting point for developing an innovative tool that will provide same day diagnosis and antibiogram for UTI, leading to more effective treatment.